饱和氢气生理盐水对大鼠肝脏冷缺血/再灌注损伤的影响

吴莉，施东婧，李津源，杜洪印，喻文立，翁亦齐（.天津医科大学一中心临床学院，天津 3009；.天津市第一中心医院麻醉科，天津 3009）

随着移植外科技术的发展，肝移植已成为终末期肝病最有效的治疗手段。然而，肝脏缺血/再灌注损伤（IRI）是导致肝移植术后肝功能障碍及衰竭的重要影响因素。氧化应激、炎症反应及细胞凋亡是引起肝脏 IRI的主要机制[1]。Ohsawa等[2]首次发现氢气具有抗氧化和抗凋亡特性，通过选择性中和羟自由基改善脑IRI和脑卒中，掀起了氢气医学研究的热潮。作为一种新型抗氧化剂，氢气已经用于保护大鼠脑、心肌和肾IRI[3-5]。本研究拟评价饱和氢气生理盐水对大鼠肝脏冷IRI的影响。

1 材料和方法

1.1 饱和氢气生理盐水（HS）制备：在400 kPa压力下将氢气溶于生理盐水6 h以达到饱和状态，采用气相色谱分析仪检测生理盐水中氢气浓度，使其浓度大于0.6 mmol/L。制备的HS于4℃常压保存，γ射线灭菌，并于24 h内使用。

1.2 动物选择及分组：24只清洁级健康成年雄性SD大鼠由解放军军事医学科学院实验动物中心提供，体重为220～250 g，采用随机数字表法分为3组（每组8只大鼠）：假手术组（Sham组）、肝脏冷缺血/再灌注组（I/R组）和饱和氢气生理盐水处理组（HS组）。

1.3 肝脏冷IRI模型的建立：大鼠术前禁食12 h，自由饮水，经腹腔注射5%水合氯醛60 mg/kg麻醉，备皮后用安尔碘消毒，行腹正中切口入腹，依次游离肝下下腔静脉、门静脉、肝固有动脉及肝上下腔静脉，并结扎肾上腺静脉，用无损伤血管夹夹闭肝固有动脉、肝下下腔静脉及门静脉后，从门静脉向肝脏方向注入1 ml肝素生理盐水，使肝脏内血液肝素化并冲回体循环。然后夹闭肝上下腔静脉，此时全肝处于无血流状态。在肝脏下腔静脉剪开1 mm开口作为灌注液流出道，将4号输液针扎入门静脉并使用0～4℃乳酸林格液灌注肝脏，滴速维持在6～8 ml/min，压力为10 kPa，冷灌注时间为30 min。停止灌注后，用8-0血管线缝合肝下下腔静脉开口及门静脉穿刺点，然后松开血管夹，肝脏血流恢复，检查腹腔无异常后用温生理盐水冲洗后关腹。

1.4 血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-10（IL-10）水平测定：各组大鼠均于再灌注6 h后经下腔静脉抽取血样4 ml，离心后留取上清液。采用全自动生化分析仪（Roche公司，瑞士）检测血清中ALT和AST水平，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清IL-10和TNF-α水平。

1.5 肝组织病理学观察和丙二醛（MDA）及、超氧化物歧化酶（SOD）水平测定 ：取大鼠肝左叶组织，用10%中性甲醛固定，石蜡包埋后制备病理切片，苏木精-伊红（HE）染色并于光镜下观察大鼠肝组织病理学形态。取肝中叶组织制备10%组织匀浆，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。

1.6 荧光定量PCR检测肝组织天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、Bcl-2及Bax的mRNA：采用反转录-聚合酶连反应（RT-PCR）检测，表1为相关基因的引物序列。采用RNA提取试剂盒（Takara公司，日本）提取组织样本总RNA。采用SYBR PrimeScriptTMcDNA第一链合成试剂盒（Takara公司，日本）进行反转录，具体实验操作参照产品说明书进行。以cDNA为模板，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ扩增试剂盒，分别利用caspase-3、Bcl-2及Bax的基因引物，使用ABI7300荧光定量PCR仪（Applied Biosystem，美国）进行基因序列扩增并分析处理数据。相对表达量用 2-△△Ct法计算。

表1 相关基因的引物序列

1.7 统计学处理：采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝功能及血清炎症因子改变（表2）：与Sham组相比，I/R组和HS组血清ALT、AST及TNF-α含量升高，I/R组血清IL-10含量降低，HS组IL-10含量升高（P＜0.05）。与I/R组相比，HS组血清ALT、AST及TNF-α含量均降低，血清IL-10含量升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠肝功能及血清炎症因子水平（±s）

表2 各组大鼠肝功能及血清炎症因子水平（±s）

注：与HS组相比，aP＜0.05；与I/R组相比，bP＜0.05

组别 动物数（只） ALT（U/L） AST（U/L）Sham 组 8 73.9±30.1 194.6±72.2 I/R组 8 467.3±203.6a 929.6±442.7a HS组 8 275.7±74.0ab 581.4±143.3ab组别 动物数（只） TNF-α（μg/L） IL-10（μg/L）Sham 组 8 0.0 273±0.0 044 0.2 053±0.0 497 I/R组 8 0.0 813±0.0 298a 0.1 415±0.0 233a HS组 8 0.0 520±0.0 099ab 0.3 206±0.0 648ab

2.2 肝组织病理学改变（图1）：Sham组肝组织未见明显的病理学改变。I/R组肝细胞明显肿大，偶见肝细胞气球样变及点状坏死，肝窦内红细胞淤积，部分肝血窦变窄或消失，肝小叶及汇管区中性粒细胞浸润。与I/R组相比，HS组损伤程度较明显减轻，肝细胞轻度肿胀，汇管区见少量中性粒细胞浸润。

图1 再灌注6 h时大鼠肝组织形态学改变（HE×200）

2.3 肝组织氧化应激及相关凋亡蛋白mRNA的表达情况（表3）：与Sham组相比，I/R组及HS组肝组织MDA含量、caspase-3及Bax/Bcl-2的mRNA表达水平显著升高，SOD活性显著降低（P＜0.05），HS组肝组织MDA含量、caspase-3及Bax/Bcl-2的mRNA水平比I/R组明显降低，SOD活性较I/R组升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠肝组织氧化应激及凋亡水平的比较（±s）

表3 各组大鼠肝组织氧化应激及凋亡水平的比较（±s）

注：与Sham组相比，aP＜0.05；与I/R组相比，bP＜0.05

组别 动物数（只） MDA（nmol/mg） SOD（U/mg）Sham 组 8 0.84±0.06 240.8±16.9 I/R 组 8 1.13±0.10a 194.9±20.4a HS 组 8 1.00±0.11ab 218.1±16.0ab Bax/Bcl-2 mRNA（2-ΔΔCt）Sham 组 8 1.00±0.00 1.02±0.10 I/R组 8 2.77±0.98a 1.59±0.34a HS组 8 1.46±0.33ab 1.12±0.16ab组别 动物数（只） caspase-3 mRNA（2-ΔΔCt）

3 讨 论

本研究参照Nozato等[6]研究方法建立大鼠肝脏冷IRI模型，研究结果显示，与S组相比，IR组ALT、AST及MDA水平升高，肝组织病理损伤严重，肝细胞变性及点状坏死，而SOD活性降低，提示大鼠肝脏冷IRI模型制备成功。

氢气是无色、无味、相对分子量最小的气体，能迅速扩散进入线粒体、细胞核等亚细胞器，它们是活性氧自由基（ROS）产生和DNA损伤的主要场所。氢气选择性减少羟自由基（·OH）和过氧亚硝基，而不清除具有生理功能的过氧阴离子（O-2）和过氧化氢（H2O2）[2]。本研究根据参考文献[7-8]选择于门静脉阻断前5 min经下腔静脉注射6 ml/kg饱和氢气生理盐水，结果表明饱和氢气生理盐水能够明显改善肝功能，减轻氧化应激及病理损伤，提示饱和氢气生理盐水能够显著缓解肝冷IRI。

IRI是导致肝移植术后急性肝衰竭及移植物功能障碍的主要原因，其机制可能涉及细胞内钙超载、氧自由基生成过多、炎症反应、细胞凋亡及微循环障碍等多种因素。缺血引起氧自由基积聚，并不断消耗内源性抗氧化剂。血液灌注恢复后，缺血组织进一步产生大量氧自由基，并促使中性粒细胞浸润，损伤血管内皮细胞，从而激发炎症反应，组织损伤加重，最终引起组织细胞凋亡。饱和氢气生理盐水可以减轻氧化应激引起的过氧化损伤并且减少炎症介质的释放，通过其抗氧化及抗炎症效应保护肝脏IRI[9]。氢气通过抑制氧化应激诱导的凋亡及炎症反应，从而减轻严重烧伤后早期急性肾损伤[10]。

本研究结果显示，肝脏冷I/R后肝组织损伤严重，氧化应激及炎症因子的表达量升高，细胞凋亡明显增加，活性氧自由基及炎症因子对缺血部位产生严重损伤，引起细胞凋亡及肝功能障碍。给予大鼠饱和氢气生理盐水后，肝功能明显改善，肝组织病理损伤减轻，氧化应激及炎症反应下降，细胞凋亡率减轻。因此，饱和氢气生理盐水可通过抑制肝脏氧化应激及炎症反应减轻细胞凋亡等途径缓解大鼠肝脏冷IRI。

综上所述，饱和氢气生理盐水通过其选择性抗氧化、抑制炎症反应及抗凋亡特性从而减轻肝脏冷IRI。