饱和氢气生理盐水对大鼠肝移植缺血/再灌注损伤中自噬的调节作用

施东婧，杜洪印，喻文立，吴莉，盛明薇，翁亦齐，王永旺，刘文娜，王树森（.天津医科大学一中心临床学院，天津 00070；.天津市第一中心医院麻醉科，天津 009；.国家卫生计生委危重病急救医学重点实验室，天津 009）

缺血/再灌注损伤（IRI）是导致肝移植术后肝功能衰竭和移植肝原发性无功的重要因素之一[1]。肝脏IRI的发生机制包括氧化应激、凋亡和炎症反应等。氢气因其具有选择性抗氧化作用等特性，对多脏器和细胞具有保护作用，可缓解肝脏IRI[2-5]。适度自噬是细胞代谢和更新的重要方式，但过度自噬可导致细胞过多死亡和组织器官病理损伤。研究发现[6]，自噬相关肝细胞死亡可导致移植肝功能衰竭，通过抑制剂来抑制自噬可缓解肝脏冷IRI。因此，本研究拟探讨氢气对大鼠原位肝移植IRI中肝细胞自噬的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组：无特定病原体（SPF）级成年健康雄性SD大鼠24只，体重为200～250 g，购于解放军军事医学科学院实验动物中心。采用随机数字表法分为3组（每组8只实验大鼠）：假手术组（Sham组）、原位肝移植组（OLT组）和饱和氢气生理盐水处理组（HS组）。Sham组仅进行开关腹操作，OLT组和HS组建立原位肝移植模型。HS组在肝下下腔开放即刻，经肝下下腔静脉注射6 ml/kg 4℃饱和氢气生理盐水，OLT组则注射等量4℃生理盐水。受鼠术前禁食12 h，自由饮水，术后均恢复进食。

肝移植模型建立：根据文献所述[7]，① 供体手术：大鼠腹腔注射5%水合氯醛6 ml/kg麻醉后，经上腹部行纵切口，暴露并游离第一肝门、肝上下腔静脉及肝下下腔静脉，分别结扎右肾上腺静脉、左膈下静脉和肝固有动脉。游离胆管时尽量保留周围组织。在胆总管远端的前臂剪一小口，向近端插入胆道支架管（由硬膜外导管制成，长约4～5 mm），用丝线结扎固定。在下腔静脉远端注射1 ml肝素生理盐水（2.5×104U/L）使血液充分肝素化。在左右髂总动脉分叉近端结扎腹主动脉并在结扎线以上向肝侧置管固定，用4℃肝素乳酸林格液（50 U/L）缓慢灌注（4 ml/min）。剪开肝下下腔静脉和肝上下腔静脉远端，使灌注液顺利流出。待肝脏变为土黄色后，紧贴膈肌剪断肝上下腔静脉，在剪断肝下下腔静脉和门静脉时残端尽量留长。② 供肝处理：将供肝置于4℃乳酸林格液中。选取管径合适的套管分别对门静脉及肝下下腔静脉进行套管，并用丝线固定。经门静脉缓慢注入4℃乳酸林格液再次进行灌注至流出液清亮为止。在肝上下腔静脉左右侧角各缝吊7-0血管线，以备吻合时使用。肝脏修整完毕后置于4℃冰箱保存。③ 受体手术：术前处理同供体，开腹后游离肝周韧带、血管及胆总管。阻断肝下下腔静脉、门静脉及肝上下腔静脉后剪断血管并取出肝脏。原位放入供肝，连续外翻缝合肝上下腔静脉，将供肝门脉套管套入受体门脉中，用丝线固定。开放门脉及肝上下腔静脉，结束无肝期。完成肝下下腔套管后移除止血夹，将供肝胆管支架管套入受体胆管并固定。检查无出血及异常后用温生理盐水反复冲洗腹腔，缝合腹壁切口。

1.2 制备饱和氢气生理盐水：饱和氢气生理盐水根据文献[3]所述方法制备，抽空装有生理盐水的容器内气体，并充入氢气，在400 kPa的压力下维持6 h，用气相色谱分析仪测定生理盐水中氢气是否达到饱和，氢气的浓度需大于0.6 mmol/L，制备完成后于4℃保存并于24 h内使用。

1.3 检测指标

1.3.1 肝功能及氧化应激检测：各组大鼠于再灌注后6 h，经下腔静脉采集血液标本，室温下静置后离心，收集血清，应用全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平。取肝脏组织制备组织匀浆，根据试剂盒操作说明书，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量，用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3.2 病理学检测：取大鼠新鲜肝脏组织，4℃生理盐水冲洗干净后用10%中性甲醛固定，经脱水、包埋后制备切片（切片厚度为5 μm），苏木精-伊红（HE）染色后在显微镜下观察肝组织病理改变。

1.3.3 蛋白免疫印迹试验（Western Blot）：肝组织蛋白质定量、变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺氨凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳后转膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，洗涤后加入一抗〔兔抗鼠微管相关蛋白轻链3（LC3Ⅱ）、自噬相关因子Beclin-1及磷酸甘油酸脱氢酶 （GAPDH）〕，于4℃孵育过夜，洗涤后用辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，最后洗涤干净后加入显色底物显色曝光，采用Image J图像分析软件分析条带灰度值。

1.3.4 RT-PCR 根据试剂盒说明书进行反转录和PCR反应，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参对照，计算caspase-3和Cyt-c mRNA表达水平。引物购买于北京奥科鼎盛生物工程有限公司，表1为引物序列。循环条件为：95℃预变性30 s；再95℃变性5 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min，共扩增40个循环。随后得融解曲线，使用软件对数据进行自动分析，计算达到阈值的最低循环数（Ct值）。目的基因的mRNA拷贝数以Ct值计算，每个基因均重复2次，取平均值，相对表达量用2-ΔΔCt计算。

表1 引物序列

1.3.5 统计学分析：采用SPSS19.0进行统计学分析处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组受鼠血清ALT和AST水平的比较 （图1）：与Sham组相比，OLT组和HS组血清ALT和AST水平均显著升高（P＜0.05）；与OLT组相比，HS组血清中ALT和AST水平均明显降低（P＜0.05）。

图1 各组受鼠血清ALT和AST水平比较

2.2 各组受鼠肝组织病理改变（图2）：与Sham组相比，移植术后6 h，OLT组受鼠肝组织出现明显损伤，大量肝细胞水肿，肝窦间隙变窄，炎症细胞侵润明显，大量红细胞淤积，肝窦部分区域还出现肝细胞坏死。与OLT组相比，HS组受鼠肝细胞水肿减轻，炎症细胞浸润及红细胞淤积减少。

2.3 MDA水平和SOD活性比较（表2）：与Sham组比较，OTL组和HS组受鼠，术后6 h肝组织MDA水平显著升高而SOD活性明显降低（P＜0.05）；HS组与OTL组比较肝组织氧化应激损伤减轻，MDA水平降低，SOD活性升高（P＜0.05）。

图2 各组受鼠肝脏组织病理学改变 （HE×200）

表2 氧化应激水平及caspase-3 mRNA和Cyt-c mRNA表达比较（±s）

表2 氧化应激水平及caspase-3 mRNA和Cyt-c mRNA表达比较（±s）

注：与Sham组相比，aP＜0.05；与OLT组相比，bP＜0.05

Cyt-c mRNA（2-ΔΔCt）Sham 组 8 0.64±0.07 204.13±17.75 1.09±0.18 0.99±0.17 OLT 组 8 1.25±0.13a135.78±10.92a 2.02±0.26a 1.96±0.19a HS 组 8 1.02±0.11ab158.81±12.09ab 1.67±0.17ab 1.64±0.18ab组别 动物数（只）MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）caspase-3 mRNA（2-ΔΔCt）

2.4 肝细胞胞浆中LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白的表达量（图3）：HS组大鼠肝细胞LC3Ⅱ和Beclin-1的表达均受到抑制，其表达量明显低于OTL组（P＜0.05）；而与Sham组相比，OTL组和H组LC3Ⅱ和Beclin-1的表达均显著升高（P＜0.05）。

图3 各组受鼠肝细胞LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达

2.5 各组受鼠肝组织caspase-3和Cyt-c的mRNA表达量（表2）：再灌注后6 h，OLT组受鼠肝组织caspase-3和Cyt-c的mRNA表达量较Sham组显著上调（P＜0.05）；与OLT组比较，HS组肝组织caspase-3和Cyt-c的mRNA表达水平下降（P ＜ 0.05）。

3 讨 论

IRI是肝移植术后肝功能衰竭和原发性无功的重要因素之一[7]。本研究根据文献[8]建立并改良了Kamada二袖套肝移植模型，结果表明，再灌注后6 h，与Sham组比较，OLT组ALT、AST、MDA水平和肝组织病理学损伤评分升高，SOD活性降低，提示肝移植模型制备成功。

氢气是无色、无味的小分子气体，可通过单纯扩散迅速进入细胞器内，可以直接作用于氧化应激损伤最严重的细胞器——线粒体。实验表明，氢气可选择性清除氧化活性较强的羟自由基（·OH）及过氧亚硝酸阴离子（ONOO-），而不与其他具有生物活性的氧自由基（ROS）发生反应，从而起到选择性抗氧化作用[9-10]。Fukuda等[5]发现，吸入氢气可通过减轻氧化应激，抑制肝IRI。在本研究中，与OLT组比较，HS组ALT、AST、MDA水平和肝组织病理学损伤评分明显减低，而SOD活性升高，同时caspase-3和Cyt-c mRNA表达量减低，提示静脉注射饱和氢气生理盐水可减轻肝移植中肝IRI，减少肝细胞凋亡。

自噬在细胞生存及其稳态的维持中具有重要作用。细胞可以通过自噬降解细胞内损伤的细胞器和结构不稳定的蛋白，分解得到的氨基酸等可为细胞代谢提供底物[11]。Gotoh等[6]的研究发现，自噬引起的肝细胞死亡导致移植肝功能衰竭，抑制自噬可有效缓解肝脏冷IRI。最新研究显示，在骨骼肌的IRI中，氢气可以通过抑制自噬从而起到一定的保护作用[12]。在本研究中，OLT组移植肝再灌注6 h后，自噬被激活，自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1表达上调，同时凋亡相关基因caspase-3、Cyt-c mRNA表达明显上调。开放肝下下腔静脉后注射饱和氢气生理盐水可减轻大鼠肝组织病理损伤，MDA含量明显降低而SOD活性显著升高，同时LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白以及caspase-3和Cyt-c mRNA表达均下降。LC3与Beclin-1是自噬过程中的两个重要蛋白，可反映细胞自噬活性。由此可见，肝移植IRI可上调肝细胞自噬，而静脉注射饱和氢气生理盐水可通过抑制自噬减少IRI。

综上所述，饱和氢气生理盐水可以通过抑制肝细胞自噬来缓解细胞凋亡，减轻移植肝的IRI，但氢气对自噬的调控机制还需要进一步证实。