儿童神经母细胞瘤Klf4表达及其影响因素研究

朱秀丽，曲 凡，李美楠，郑 钰，陈 健，张文婷



·论著·

儿童神经母细胞瘤Klf4表达及其影响因素研究

朱秀丽，曲 凡，李美楠，郑 钰，陈 健，张文婷

目的探讨儿童神经母细胞瘤(NB)Klf4表达情况及其影响因素。方法选取2007年1月—2013年3月于河北医科大学第四医院儿科治疗的NB患儿33例为病例组，另选取同期本院严重肾盂积水患儿10例为对照组。记录两组患儿临床资料，取病例组病理组织，对照组残余的正常肾上腺组织，采用免疫组化SP法检测Klf4表达情况，根据染色强度和Klf4阳性细胞所占百分比评价Klf4表达强度。结果病例组Klf4表达阳性10例(30.3%)，对照组Klf4表达阳性9例(9/10)，病例组Klf4表达阳性率低于对照组(χ2=8.801，P=0.003)。病例组不同性别、年龄、病理分期患儿Klf4表达阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。病例组节细胞-神经母细胞瘤患儿Klf4表达阳性率高于神经母细胞瘤患儿，术前化疗患儿Klf4表达阳性率高于术前未化疗患儿(P<0.05)。结论NB患儿Klf4表达下降，且与NB分型有关，术前化疗药物可能对Klf4的表达产生影响。

神经母细胞瘤；Klf4；儿童

朱秀丽，曲凡，李美楠，等.儿童神经母细胞瘤Klf4表达及其影响因素研究[J].中国全科医学，2016，19(30)：3694-3697.[www.chinagp.net]

ZHU X L,QU F，LI M N,et al.Expression and influence factors of Klf4 among children with neuroblastoma[J].Chinese General Practice，2016，19(30)：3694-3697.

神经母细胞瘤(NB)是儿童最常见的颅外实体肿瘤，占儿童肿瘤的7%～10%[1]。NB恶性程度高，易早期转移，多数患儿就诊时已达中晚期。化疗是NB的主要治疗手段，治疗过程中易出现化疗耐药和复发，治疗效果差，预后不良。目前，随着对肿瘤的不断深入研究，有学者提出肿瘤干细胞(TSCs)的概念，并认为TSCs在恶性肿瘤发生、发展、转移、化疗耐药及复发中发挥重要作用，其特性决定肿瘤治疗的敏感性和结局[2]。Klf4为胚胎性干细胞转录调控基因，是调控胚胎发育的关键因子，在胚胎早期发育过程中对维持胚胎干细胞多潜能性和自我更新能力具有关键性的调控作用，并且对于维持TSCs的特性也发挥重要作用[3]。目前，Klf4在NB中作用的研究报道较少。本研究旨在通过观察干细胞转录因子Klf4在NB中的表达，分析其与患儿临床病程、病理类型的关系，探索其在NB发生、发展中发挥的作用，为临床NB的诊治提供参考。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2007年1月—2013年3月于河北医科大学第四医院儿科治疗的NB患儿33例为病例组，其中男21例，女12例；年龄1～9岁，中位年龄5(3)岁。纳入标准：(1)根据组织学及免疫表型特点，经手术切除或活检病理检查证实为NB；(2)年龄<14岁；(3)临床资料完整，病理标本能够满足本研究需要。

1.2方法

1.2.1资料收集记录两组患儿性别、年龄、疾病分型、病理分期及术前是否化疗。

1.2.2Klf4表达检测Klf4兔抗人多克隆抗体购自Prosci Incorporated公司，按1∶100稀释；免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。取病例组病理组织标本，对照组残余的正常肾上腺组织标本。标本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片厚度4 μm，依次经固定、脱水、热抗原修复、过氧化酶活性阻断、封闭抗原、一抗及二抗孵育、显色、复染、封固处理，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，选择实验获得阳性标本作为阳性对照。Klf4染色阳性部位位于NB细胞质，根据染色强度分为:0分(无色)、1分(淡黄色)、2分(棕黄色)、3分(棕褐色)。根据Klf4阳性细胞所占百分比分为0分(阴性)、l分(阳性细胞所占百分比≤10%)、2分(阳性细胞所占百分比为11%～50%)、3分(阳性细胞所占百分比为51%～75%)、4分(阳性细胞所占百分比≥76%)。以两者评分乘积将Klf4表达强度分为4个等级：阴性(0～2分)、弱阳性(3～4分)、中度阳性(5～8分)、强阳性(9～12分)[1]。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计分析，非正态分布的计量资料以M(QR)表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料比较采用χ2检验或Fisher′s确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组Klf4表达阳性率比较病例组Klf4表达阳性10例(30.3%)，对照组Klf4表达阳性9例(9/10)，病例组Klf4表达阳性率低于对照组，差异有统计学意义(χ2=8.801，P=0.003，见图1，本文彩图详见本刊官网www.chinagp.net相应文章附件)。

2.2病例组不同临床特征患儿Klf4表达阳性率比较病例组不同性别、年龄、病理分期患儿Klf4表达阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。病例组节细胞-神经母细胞瘤患儿Klf4表达阳性率高于NB患儿，术前化疗患儿Klf4表达阳性率高于术前未化疗患儿，差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

注：A示Klf4在病例组神经母细胞瘤中呈中度阳性表达，B示Klf4在病例组神经母细胞瘤中呈弱阳性表达，C示Klf4在病例组神经母细胞瘤中呈阴性表达，D示Klf4在对照组中呈中度阳性表达

图1两组Klf4的表达(SP染色，×200)

Figure 1Expression of Klf4 in two groups

表1病例组不同临床特征患儿Klf4表达阳性率比较〔n(%)，N=33〕

Table 1Comparison of the positive rate of Klf4 expression among different clinical features in case group

临床特征例数阳性阴性P值性别0.433 男215(23.8)16(76.2) 女125(41.7)7(58.3)年龄(岁)1.000 ≤5185(27.8)13(72.2) >5155(33.3)10(66.7)疾病分型0.010 节细胞-神经母细胞瘤96(6/9)3(3/9) NB244(16.7)20(83.3)病理分期0.444 Ⅲ期104(4/10)6(6/10) Ⅳ期236(26.1)17(73.9)术前化疗<0.001 是139(69.2)4(30.8) 否201(5.0)19(95.0)

注：NB=神经母细胞瘤

3　讨论

Klf4是Kruppel样转录因子家族成员之一，因其常表达于胃肠道上皮细胞，故又称胃肠富集Kruppel样因子。Kruppel样转录因子家族成员的共同特点是具有多个串联型的C2H2(Cys2-His2)锌指样结构，能够识别并特异性结合在富含GC的序列上。人类Klf4基因位于染色体9q31，长5 631 bp，有5个外显子，编码513个氨基酸残基组成的蛋白，相对分子质量为54 671。Klf4在人体内多种组织和细胞中广泛表达，参与多种生理功能，如胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡、维持干细胞的全能性等[4-7]。作为抑癌基因或癌基因，Klf4在肿瘤的发生、发展及转移过程中发挥完全不同的作用。如Klf4可维持乳腺癌肿瘤干细胞的自我更新，促进癌细胞的侵袭和转移，发挥癌基因作用[8]。而在非霍奇金及经典霍奇金淋巴瘤中则发挥抑癌基因的作用，GUAN等[9]研究显示，在伯基特淋巴瘤细胞系中，Klf4可阻滞肿瘤细胞的细胞周期处于G0/G1期，从而抑制肿瘤细胞的增殖，并且诱导其凋亡。

本研究显示，病例组Klf4表达阳性率低于对照组，提示Klf4在NB发生过程中可能发挥抑癌基因作用。研究发现，Klf4在同种肿瘤中可发挥癌基因和抑癌基因两种完全相反的作用：如WEI等[10]研究认为，Klf4在胰腺癌中发挥癌基因的作用，并且Klf4表达上调能够导致胰腺癌患者的生存时间缩短；而ZAMMARCHI等[11]研究显示，在胰腺导管细胞癌中，基因组的缺失导致了Klf4的表达缺失，Klf4基因修复可抑制癌细胞的增殖，说明Klf4在胰腺癌发生过程中发挥抑癌基因的作用。在针对前列腺癌的研究中发现，前列腺癌、前列腺上皮内瘤变组织及前列腺正常组织Klf4表达水平依次降低，提示Klf4可能发挥了癌基因的作用[12]。而WANG等[3]研究则显示，在前列腺癌细胞株Dupro和PC-3中，Klf4发挥抑癌基因作用，恢复Klf4的表达，可使细胞周期停滞于G2/M期，并且伴有cyclinB基因表达下调，提示Klf4基因可通过调节细胞周期蛋白使细胞周期停滞于G2/M期，抑制肿瘤细胞增殖。SHUM等[13]研究证实，但Klf4在NB中也发挥着抑癌基因的作用。但Klf4既可以作为癌基因，又可以作为抑癌基因的具体机制尚不明确。

本研究发现，病例组节细胞-神经母细胞瘤患儿Klf4表达阳性率高于NB患儿，提示Klf4表达水平与疾病分型相关。SHUM等[13]研究发现，Klf4过表达可使NB细胞失去神经母细胞的表型，而出现非致瘤性的平滑肌细胞的标志。FEINBERG等[14]在白血病细胞HL-60中也发现，敲除Klf4可抑制佛波酯所诱导的单核细胞分化，而Klf4过表达可使HL-60表现出成熟的单核细胞特征，因此笔者认为Klf4是单核细胞分化调控网络中重要的调节因子。Klf4低表达与肿瘤的恶性程度有关，可能成为判断预后的指标。在未来的研究中，可通过尝试上调Klf4表达，诱导NB向分化良好的类型转化，降低NB的恶性程度，改善患者预后。

本研究发现，病例组术前化疗患儿Klf4表达阳性率高于术前未化疗患儿，提示化疗药物的使用可上调Klf4的表达。MOHAN等[15]研究显示，Klf4在恶性NB细胞系中发挥肿瘤抑制因子作用，可通过下调抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达，增强芹黄素对于恶性NB的抗癌作用。因此，上调Klf4表达的化疗药物在NB治疗中可能获得更好的疗效。本研究未发现不同性别、年龄、病理分期的NB患儿Klf4表达阳性率间存在差异。

综上所述，NB患儿Klf4表达下降，且与NB分型有关，术前化疗药物可能对Klf4的表达产生影响。本研究纳入的NB患儿均为中晚期(Ⅲ～Ⅳ期)，未能与NB早期(Ⅰ～Ⅱ期)患儿的Klf4表达阳性率比较，故结果尚存在一定的局限性。

作者贡献：朱秀丽进行课题设计与实施、资料收集整理、成文并对文章负责；李美楠进行课题设计与实施、评估、资料收集整理；郑钰、陈健、张文婷协助收集资料；曲凡进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：吴立波)

Expression and Influence Factors of Klf4 among Children with Neuroblastoma

ZHUXiu-li,QUFan，LIMei-nan,ZHENGYu,CHENJian,ZHANGWen-ting.

DepartmentofPediatrics,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

Correspondingauthor:QUFan，DepartmentofPediatrics,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China；E-mail：13831128697@163.com

ObjectiveTo explore the expression and influence factors of Klf4 among children with neuroblastoma(NB).Methods33 children with NB who were treated in Department of Pediatrics of the Fourth Hospital of Hebei Medical University from January 2007 to March 2013,were selected as the case group,and 10 children with serious hydronephrosis in this hospital during the same period,were selected as the control group.The clinical data of two groups of children were recorded,the pathological tissues of the case group and the residual normal adrenal tissues of the control group were used as study subjects,the method of immunohistochemical SP was used to detect Klf4 expression.The expression intensity of Klf4 was evaluated according to the staining intensity and the percentage of Klf4 positive cells.Results10 cases(30.3%) in the case group had positive expression of Klf4,and 9 cases(9/10) in the control group had positive expression of Klf4,and the positive rate of Klf4 expression in the case group was significantly lower than that in the control group(χ2=8.801，P=0.003).In the case group,there was no significant difference in the positive rate of Klf4 expression among children with different sex,age and pathological stages(P>0.05).In the case group,the positive rate of Klf4 expression among children with ganglioneuroblastoma was significantly higher than that among children with neuroblastoma,and the positive rate of Klf4 expression among children who underwent preoperative chemotherapy was significantly higher than that among children who did not underwent preoperative chemotherapy(P<0.05).ConclusionThe level of Klf4 expression among children with NB is low,and level of Klf4 expression is related to NB classification.Preoperative chemotherapy drugs may influence the expression of Klf4.

Neuroblastoma；Klf4；Child

050011河北省石家庄市，河北医科大学第四医院儿科(朱秀丽，曲凡，郑钰，陈健，张文婷)；承德医学院附属医院儿科(李美楠)

曲凡，050011河北省石家庄市，河北医科大学第四医院儿科；E-mail：13831128697@163.com

R 730.264

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.30.011

2016-03-20；

2016-07-18)