基于组织学连续切片的三维重建技术

党海霞,令春艳,陈洪涛

(1.大连医科大学 口腔医学院，辽宁 大连 116044；2. 大连医科大学附属大连市口腔医院 口腔外科，辽宁 大连 116021)



基于组织学连续切片的三维重建技术

党海霞1,令春艳1,陈洪涛2

(1.大连医科大学 口腔医学院，辽宁 大连 116044；2. 大连医科大学附属大连市口腔医院 口腔外科，辽宁 大连 116021)

组织学连续切片的三维重建技术，因其分辨率高,能精确再现组织内部结构,已在生物科学领域广泛应用，成为三维重建领域不可替代的部分。本文重点介绍了组织学切片三维重建的方法和三维重建的软件，提出了医学图像三维重建技术发展所面临的相关问题，在此基础上得出计算机辅助组织学切片三维重建技术在医学研究领域的优势，并总结了该技术在医学研究中的一些应用，以期对相关研究提供借鉴。

组织学连续切片；计算机；三维重建

[引用本文]党海霞,令春艳,陈洪涛.基于组织学连续切片的三维重建技术[J].大连医科大学学报，2016,38(5)：506-510.

三维重建或三维可视化目前在医学领域应用甚广[1-2]。最近，微形态图像重建评估技术已经应用到再生医学，许多类型的三维重建成像和可视化技术可高分辨率显示组织微观结构[3]。然而除了微型计算机断层扫描(microscopic X-ray computed tomography，microCT)和激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)，其余三维重建技术都很难达到的二维光的亚微米分辨率显微图像，但microCT对特定染色的组织成分难以实现三维重建，而CLSM在重建组织的厚度方面成像有一定程度的限制，对一些荧光标记物很难发现且对样本标记物的平均分配也很困难[4-6]。

相对上述技术，连续组织学切片的计算机三维重建技术在这些方面具有优势。对连续组织切片进行三维重建，不但能精确地显示生物组织复杂的三维结构，并可进行随意旋转、剖切等操作，结合应用测量软件，还可对三维重建的结构进行测量，可获得面积、体积、长度、和角度等精确的解剖参数。该技术正越来越广泛地应用于形态学、比较生物学、解剖学、分子生物学等领域[7-9]。本文就计算机辅助组织学切片三维重建技术的三维重建方法和优势及其在医学研究中的应用进行综述。

1　组织学切片三维重建方法

组织学连续切片计算机辅助三维重建的大致步骤包括组织获取、固定、包埋、连续切片、切片染色、图像采集，最后借助软件进行图片配准后采用相应的算法实现组织结构的三维重建。

1.1三维重建前的处理

1.1.1组织获取、固定和包埋：处理获取组织时要确保修剪得当，不损伤样品结构，避免长时间暴露在空气中或脱水。获取的组织要及时固定，根据组织类型，目标成分和染色方法选用合适的固定方法和固定液。组织学包埋切片的方法较多，如石蜡、明胶、碳蜡和火棉胶包埋等，以石蜡包埋法最为常用。三维重建对石蜡切片准确度要求很高，对于大块组织的包埋与切片，特别是富含纤维及肌肉组织的标本，可选用火棉胶包埋。对于硬组织可采取微型磨削技术或脱钙后进行切片[10-11]。

1.1.2连续切片和染色：完整连续的切片是进行后期重建的重要基础，任何一种方式的连续切片最好是连续的、等距的、平整的，避免丢失和变形。连续切片越薄，数目越多，变形越少，信息越丰富，组织界限特征越分明，重建图像就越逼真[12]。染色的整体要求是不同结构易于辨认区分，常规HE染色一般可满足三维重建需要。对某些特殊组织结构，可根据组织特点选择特异性的染色方法便于图像采集后能够快速选取所需研究的对象，从而提高效率[13-14]。如利用螺旋CT，苏木精-伊红染色，Mallory三色染色可实现三维重建监测海藻酸钠-明胶共混体系/成骨细胞凝胶修复兔颅骨缺损的愈合过程[14]。

1.2图像采集

由于对减小误差和要求组织三维重建的细致化、清晰化的追求，随着计算机技术的不断发展和进步，近年来除对硬件要求高分辨率以外，这一过程已由传统的手动拍照逐渐转向自动化连续成像系统的开发与改良[15-16]。

1.3计算机辅助三维重建软件

目前组织学切片三维重建软件的总趋势是易用、高效和开源，具有图片定位、配准、压缩、自动切割、数据读取等基本功能，能精确地生成组织复杂的生物体三维结构，并可进行任意旋转、剖切等观察和操作，并能输出多种格式便于后期渲染和传播[17-20]。国内外报道的用于图像三维重建的软件有很多，如3D-Slice，3D-Doctor，3d-Max，Neuro Tracer3D，ZAIO900，3D-MED，Reconstruct等。其中，3D-Doctor 是一款先进的三维图像处理和测量软件，可应用于医学方面三维图像处理程序[21]。

1.4组织学切片显微结构的三维重建

1.4.1切片图像的排齐：切片图像的排齐是指将一幅图像与另一幅图像上的对应点达到空间位置和解剖结构上的一致，使一系列切片的空间位置与其原标本位置相对应，以达到重建的最佳效果。配准的结果应使两幅图像上所有的解剖点，或至少是所有具有诊断意义的点都达到匹配[22]。

1.4.2图像的追踪分割技术和重建后的输出和渲染：常见的分割技术有微分算子边缘检测、阈值分割技术、区域增长技术和聚类分割技术[23-24]。目前，医学图像分割的研究多数是针对CT和MRI图像，组织切片图像为真彩色图像，而彩色图像的分割一直是图像处理领域中的难点，将彩色图像转换为灰度图像，然后用灰度图像分割算法分割。也可利用Photoshop提供的画笔(Brush)，套索(Lasso)等图像分割工具进行手工分割的办法。重建后的图片一般输出为VRML 2.0，VRML 1.0，DXF,Bitmap,360Bitmaps等格式。后导入3D Max(Autodesk公司)，Maya(美国Autodesk公司)等软件进行渲染。

2　基于组织学切片的三维重建在医学研究中的优势及应用

在医疗干预(如术中使用图像引导系统或基于图像的术前计划)以及再生医学研究中，计算机辅助建立三维模型起到了一个关键性的作用。然而像侧颅底，尤其是听觉系统一些特殊的组织结构，由于其组织结构高度的复杂性，小尺寸和广泛的组织分化，这对于计算机辅助建立三维模型研究是一个具有挑战性的领域。随着研究技术的不断发展，显微切割技术虽然提供了非常详细的颞骨的组织学图像，但其并不适用于体积三维重建。而多层计算机断层扫描(multi-slice computed tomography，MSCT)、基于平板探测器计算机断层扫描(flat-panel detector-based volume computed tomography，fp-VCT)和microCT很难同时获得骨结构和薄软组织的图像，磁共振成像分辨率不到1 mm难以实现可视化。虽然磁共振显微镜和其他一些实验方法如光学相干显微镜和正交平面荧光光学切片显微镜断层扫描，可改善到微观范围内但仍无法结合空间分辨率和高分辨率同时观察骨组织和软组织的代表性组织结构。目前看来，基于组织学连续切片的三维重建技术是克服上述问题的最佳选择方法。运用该技术空间分辨率可通过提高调节放大倍数和切片厚度来加以提高，对于不同分化组织可以通过特定染色来加以区分。在医学临床与研究领域，通过连续切片三维重建技术，可以得到医学影像数据中隐含的三维解剖结构和功能信息，为医疗人员提供病变区域的三维数据，以便于从多角度、多层次进行观察，并对特定区域进行准确的定量分析。见图1。

图1　基于组织学切片的三维重建示意Fig 1 3D reconstruction of series histological sections

目前在医学研究领域已经有众多学者运用连续切片三维重建技术进行了相关研究，如国外Teutsch等[25]利用大鼠肝脏组织学切片，采用特殊染色葡萄糖-6-磷酸酶染色，三维重建后可清晰观察到肝实质的边界结构。Song等[7]通过头皮皮肤连续切片的三维重建来描述立毛肌和皮脂腺的形态学关系。此外，有研究者利用人颞骨(包含中耳和内耳结构)作标本，将标本用环氧树脂包埋，然后运用连续磨削(使用精度为1 μm的触觉长度计磨削)并获得相关数据进行三维重建，为软组织和骨组织结构提供了一个具有高对比度和高分辨率的成像方式[22]。更有学者利用该技术在呼吸系统方面进行了研究，研究者利用番鸭肺的三维重建来阐明了禽肺终端呼吸装置的微观结构。将肺用2.5%的戊二醛磷酸盐缓冲液气管内滴注固定，并沿肋沟作横切片。将含侧支气管的标本用环氧树脂包埋。用玻璃刀将组织切为厚度为0.3 μm的切片。感兴趣的结构鉴定用甲苯胺蓝染色。运用软件进行三维图像重建后使肺的空气毛细血管和毛细血管得到了很好的显现[12]。

又如国内将这一技术应用于数字人数据的获取，Li等[26]开发出了一套基于序列切片实时成像的三维重建系统，获得小鼠全脑的微米级分辨率的三维结构。也有学者利用该技术通过将人体正中神经三维重建实现了感觉和运动神经三维可视化。研究者将正中神经标本用液氮固定，切片厚度为20 μm。用乙酰胆碱酯酶组织化学染色，三维重建后很好的显现了运动神经纤维和感觉神经纤维[24]。此外，通过结合连续切片技术与免疫组化、免疫荧光技术(特别是多重标记的技术)，还可以对感兴趣的目标抗原(蛋白、多肽等)进行定向定量研究，如利用Array tomography(连续超薄切片与多重免疫荧光标记的结合)技术首次检测了单个神经突触的蛋白质组成、利用超薄切片重建出人体视神经头的筛状板和巩膜通道高分辨的三维结构、利用连续超薄切片技术对斑马鱼视神经顶盖中的基因神经元类型进行了特性描述等[27-29]。这些研究对提高医学图像的利用价值有深远的意义，而且对提高临床诊断的准确性和正确性有很大益处。表1总结了基于组织学连续切片的三维重建在医学研究中的一些应用。

表1　基于组织学连续切片的三维重建的应用

3　结　语

三维成像和可视化技术子在科研中具有重要的功能，让科学家可以从多角度研究组织结构。虽然目前出现很多新的三维成像和可视化技术，但是基于组织学切片的光学显微镜图像的三维重建几乎是任何类型的组织用于获得高分辨率重建的最好方法之一。此外，这种技术对于标本的最大大小不具有限制性,甚至整个人体可以切成组织切片而进行三维重建。但目前组织学切片三维重建方法还面临许多问题，如劳动强度大，精确配准难、软件的算法和智能化水平还有待提高等。未来还需要多领域和多学科的深入合作探索，实现理论和算法的突破，提高软件的智能化水平，满足基于组织学切片的三维重建研究的需要。

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Advances in three-dimensional reconstruction of serial histological sections

DANG Hai-xia1, LING Chun-yan1, CHEN Hong-tao2

(1.SchoolofStomatology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China;2.DepartmentofStomatology,theAffiliatedStomatologicalHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116021，China)

Three-dimensional (3D) reconstruction of series histological sections is one of the most powerful methods for accurate high-resolution representation of almost any type of tissue structures. It has been widely applied in biological sciences. We introduced 3D reconstruction method and 3D reconstruction software. Moreover, we put forward advantages of 3D reconstruction technique of series histological sections and its application in medical research.

histological serial sections; computer; three-dimensional reconstruction

党海霞(1987-)，女，山西吕梁人，硕士研究生。E-mail：779021519@qq.com

陈洪涛，副主任医师。E-mail：chenhtdsh@163.com

��述

10.11724/jdmu.2016.05.22

R445.9

A

1671-7295(2016)05-0506-05

2016-03-22;

2016-09-11)