导流杂交HPV检测在宫颈病变筛查中的价值

张　辉，薛　白，金仙玉

(大连市中心医院 妇产科，辽宁 大连 116011)



导流杂交HPV检测在宫颈病变筛查中的价值

张辉，薛白，金仙玉

(大连市中心医院 妇产科，辽宁 大连 116011)

目的评价应用导流杂交技术(凯普导流杂交)HPV检测法(HybriMax)行宫颈癌及癌前病变筛查的效果及作为首选筛查方法的可行性。方法统计分析2013年12月至2015年12月采用导流杂交技术，检测HR-HPV亚型的女性共7056例，分为5个年龄段：≤29岁；30～39岁；40～49岁；50～59岁；≥60岁。研究HR-HPV各亚型感染情况，不同年龄的HPV感染状况。计算导流杂交检测结果对筛查CIN2及以上病变的灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值，评价其作为宫颈癌及癌前病变初筛方法的可能性。所有数据采用SPSS13.0软件进行统计分析，P<0.05定义为统计学有显著差异。结果HR-HPV感染率总体呈现随年龄增长而增高趋势，各年龄段HR-HPV感染率总体比较差异有显著性意义(χ2=23.61，P<0.05)。以病理诊断为金标准，与宫颈高级别病变(≥CIN2)最密切的亚型是HPV16、58和33型，占所有≥CIN2病变的70.86%(124/175)；导流杂交技术HPV检测对筛查宫颈癌及癌前病变的敏感度为95.30%，特异度为40.64%，阳性预测值为39.01%，阴性预测值为95.59%。结论中老年女性HR-HPV感染比例高，不能忽视该人群HPV筛查及感染情况；导流杂交技术有较好的敏感度及阴性预测值，在筛查宫颈癌及癌前病变中有指导意义；作为宫颈筛查方法仍需联合TCT等细胞学筛查进一步分流或按目前指南进行联合筛查。

宫颈病变；HPV；HR-HPV-DNA检测；导流杂交；中老年

[引用本文]张辉，薛白，金仙玉.导流杂交HPV检测在宫颈病变筛查中的价值[J].大连医科大学学报，2016,38(5)：444-449.

目前宫颈癌筛查最常用的两种方法是宫颈细胞学检查和人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)DNA检测。目前被美国FDA认证的检测HPV的方法主要有4种: Hybrid Capture 2、Cervista、cobas 4800和Aptima HPV E6/E7 mRNA。在中国，应用较多的导流杂交技术(HybriMax)，是唯一通过国家CFDA认证的，由中国自主研发基于PCR基因芯片检测法的一种可对HPV进行分型检测的方法。可一次性检测21种HPV亚型，不仅包括15种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)，还能检测出6种低危型HPV(6、11、42、43、44、81)，具有检测时间少、准确性高和可以具体分型HPV等优点。本研究通过分析2013年12月至2015年12月于大连市中心医院就诊行导流杂交 (HybriMax)进行宫颈筛查的7056例女性的临床资料，探讨导流杂交技术检测高危型HPV(high-risk HPV, HR-HPV)作为宫颈癌及癌前病变的首选筛查方法的可行性。

1　资料与方法

1.1一般资料

收集2013年12月至2015年12月于大连市中心医院就诊的女性，共7056人，年龄21～70岁，平均(40.22±8.93)岁，分为5个年龄段：≤29岁；30～39岁；40～49岁；50～59岁；≥60岁。所有女性均有性生活史、处于非妊娠期、无盆腔放疗、化疗病史，就诊原因包括常规妇科体检、白带异常、性交或接触性阴道不规则流血等。其中5105例同时行液基细胞学技术(thinprep cytology test, TCT)检查。TCT检查结果异常(ASCUS及以上)，HPV16或18阳性或有明显临床症状的523例行阴道镜宫颈组织活检诊断。

1.2仪器与试剂

采用由凯普生物化学有限公司提供的，可对于21种HPV进行检测的基于核酸分子快速导流杂交分型技术的基因芯片检测系统。

1.3方法

1.3.1HPV样本采集、处理方法及诊断标准

由妇产科医生进行宫颈标本取样，宫颈刷同方向旋转3～5圈，得到足量的移行区上皮细胞样本，浸泡在3 mL的专用细胞保存液中，放置4 ℃冰箱中，3 d内进行检验。

过程：(1)样本DNA提取：取样本0.5 mL，14000 r/min离心15 min，弃掉上层清液，用核酸提取试剂盒抽提DNA；(2)PCR扩增：将PCR反应剂与DNA tap酶按比例混合均匀后，每反应试管加入24 μL，再加入DNA模板1 μL，所有混合后进行PCR扩增。(3)导流杂交：在杂交平台上放置标记有寡核苷酸探针的基因芯片，照试配套剂盒说明书进行导流杂交、酶标显色。(4)结果判定：直接观察检测结果，如见到明确蓝紫色圆点为阳性，依据膜条HPV分型分布图，对照判断阳性点为何种HPV亚型。本次研究主要分析15种HR-HPV感染情况，感染HR-HPV判定感染阳性，同时感染2种及以上HR-HPV者定义为多重感染。

1.3.2TCT样本采集、处理方法及诊断标准

采集方法同HPV，样本置于保存液的标本瓶中，采用ThinPrep2000系统处理标本，得到直径为2 cm的细胞涂片，95%乙醇固定15～30 min，行巴氏染色。采用TBS(the Bethesda system)分级标准进行细胞学诊断，将结果为ASCUS及以上判定为TCT检测结果阳性。

1.3.3病理检查及诊断标准

以组织病理诊断为确定宫颈病变的金标准：病理诊断结果按提示的最高级别病变作为最后诊断(如CIN1～2诊断为CIN2)；如诊断结果有累及腺体，按原级别诊断(如CIN1累腺诊断为CIN1)。病理诊断为CIN2及以上或子宫颈腺上皮内瘤变(CGIN)2及以上者定义为宫颈高级别病变，即病理检测结果阳性。

1.4分析指标

分析HR-HPV的感染率；感染亚型分布；各年龄段HR-HPV感染率；不同程度宫颈病变的感染率及感染亚型分布；HR-HPV感染的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。

1.5统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，各年龄段患者HR-HPV感染率比较及不同程度子宫颈病变患者HR-HPV感染率比较，采用卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结　果

2.1HR-HPV感染情况

HR-HPV总感染率17.96%(1267/7056)，感染者平均年龄(38±10)岁。其中，HR-HPV单一亚型感染率为14.02%(989/7056)，多重感染率为3.94%(278/7056)。HPV16型为最多感染亚型，占4.81%(340/7056)。15种高危亚型均被测出，感染亚型按感染率递减顺序依次排列见表1。

表1　HR-HPV感染的不同亚型感染率

混合感染按亚型重复计数

2.2不同年龄段患者HR-HPV感染率比较

不同年龄段患者HR-HPV感染率比较见表2，其总体呈现随年龄增长而增高趋势，各年龄段HR-HPV感染率总体比较差异有显著性意义(χ2=23.61，P<0.05)。

表2不同年龄段患者HR-HPV感染率比较

Tab 2 Comparison of HR-HPV infection rate at different ages

年龄(岁)例数阳性数感染率(%)≤29121822418.3930～39234838616.4440～49218236516.7350～5996021822.70≥603487421.26

2.3不同程度子宫颈病变患者HR-HPV感染率比较

523例行阴道镜后病理诊断，病理检查率7.41%(523/7056)。子宫颈上皮细胞异常185例，病理检查阳性患者28.49%(149/523)。HR-HPV检出率CIN1组97.22%(35/36)、CIN2组为97.62%(41/42)、CIN3组94.59%(70/74)、宫颈癌组93.94%(31/33)；不同宫颈病变各组的HPV感染率总体比较差异无显著性意义(χ2=1.102，P>0.05)。

2.4不同子宫颈病变患者的具体HR-HPV亚型感染情况

将多重感染病例亚型及宫颈病变均分别计算，共560例数据。其中CIN1有45例，检出率前3位的HR-HPV亚型依次为16型(26.67%)、52型(17.78%)和58型(13.33%)；宫颈高级别病变(≥CIN2)共173例(包括50例CIN2、86例CIN3和37例宫颈鳞癌)，HR-HPV感染率最高的前3位分别为16型(50.86%)、58型(10.86%)和33型(9.14%)，共占病理阳性(≥CIN2)的70.86%(124/175)。宫颈腺上皮阳性的2例患者(1例为CGIN 3、1例为腺癌)所感染的HPV型均为18型单一感染。见表3。

2.5TCT在宫颈病变筛查中的价值

TCT检测结果阴性151例，阳性372例(包括ASC-US 140例、LSIL 60例、ASC-H 20例、HSIL57例、AGC 1例)。与病理组织学检查对比，TCT的敏感度为85.21%，特异性45.60%，阳性预测值65.05%和阴性预测值72.18%。见表4。

2.6导流杂交HR-HPV检测在宫颈病变筛查中的价值

与病理组织学检查对比，导流杂交检测HR-HPV的敏感度为95.30%，特异度为40.64%，阳性预测值为39.01%，阴性预测值为95.59%。见表5。

3　讨　论

根据最新的世界癌症统计，子宫颈癌(cervical cancer，CC)是全球女性中第四位常见的癌症，每年有52.8万的新发病例，26.6万死亡病例[1]。导致CC发生的最主要致病因素是HR-HPV的持续性感染。所以积极有效地开展宫颈筛查，尽早诊断并干预能够显著降低CC的发病率[2]。

3.1导流杂交检测HR-HPV感染

导流杂交技术是应用PCR基因芯片的一种HPV-DNA检测方法,一张杂交膜上就可以显示21种HPV亚型的感染情况。能检测单一型感染和多重感染。而本实验应用导流杂交检测的HR-HPV总感染率17.96%，与大连地区之前应用导流杂交检测法得到的感染率相近[4]。有研究表明世界范围内最常见的HR-HPV感染亚型是HPV16、HPV18、HPV52、HPV31、HPV58[5]。本研究得出HR-HPV感染者中，感染率为前3位亚型依次为HPV16型(23.49%)，HPV52型(14.11%)和HPV58型(13.05%)。研究得出的感染亚型结果符合以往大量研究结果。

表3　不同子宫颈病变患者的具体HR-HPV亚型感染情况

表4　TCT与病理组织学结果对比

表5　HR-HPV与病理组织学验证

3.2年龄对于HR-HPV感染的影响

目前已经有国内外大量研究提出, HR-HPV感染率因年龄不同亦有所差异[9-12]，但两者之间具体的关联性各学者观点仍不统一。Baseman等[13]研究提出HR-HPV总感染率与年龄之间正相关，年龄越大感染率也越高。也有研究发现HR-HPV感染年龄曲线呈U型分布,<20岁年龄组和≥65岁年龄组感染率均为最高,40岁年龄组值最低[14]。本研究结果提示50～59岁组年龄组女性HR-HPV感染率最高，为22.70%；其次为≥60岁组，为21.26%；同时≤29岁组感染率也较高，为18.39%；最低的感染率为30～39岁组。各年龄组HR-HPV阳性率与不同年龄关系图分布类似“N”型。

本研究中≥60岁组中检测人群总体数量较少，仅为4.93%(348/7056)，但HR-HPV感染率较高，为21.26%，居各年龄段第二位，分析其原因：(1)该年龄段的中老年女性因绝经激素水平变化等方面影响，自身免疫力下降，无法像年轻女性那样能清除一过性的HPV感染，从而使HPV持续存在感染而诱发宫颈病变；(2)根据中国国情，很多60岁以上女性，既无经济条件，也无筛查意识，多数患者为首次进行HPV检测，这也是导致其感染率较高的重要原因之一。因此对于60岁以上中老年女性，仍需高度重视HPV的筛查与感染情况。

3.3宫颈癌及其癌前病变与HR-HPV

随着近年来欧美等发达国家对用HPV作为筛查宫颈癌的方法的逐渐重视，有大量的研究提出初筛应用HPV分型检测与应用细胞学检查比较，HPV检查更有优势能发现更多的子宫颈病变[15]。

本研究中，523例行病理检查的患者中，病理检查阳性(包括≥CIN2或≥CGIN2)患者的比例为28.49%(149/523)，检出率最高的3个HR-HPV亚型依次为16型、58型和33型，在病理诊断阳性中所占比例为70.86%，提示这3种HPV亚型的致病性比其他型强，这与另一项对中国5个省份的女性筛查得到宫颈病变的HPV感染亚型结果一致。临床工作中，对这3种亚型感染的患者需要给予更多的关注与随访。同时此次试验中CIN1感染的主要亚型为HPV16、52和58型。其中HPV52型，在正常宫颈及低级别宫颈病变(≤CIN1)中感染率均为继16型之后第二高的类型，但在高级别宫颈病变(≥CIN2)中感染率却不高，提示HPV52型的致病力要相对较弱或一过性比较高。有研究表明，在CC的发生发展过程中，HPV52型的E6和E7基因具有限制细胞转化的能力,几乎不会与宫颈细胞基因组相整合，因此感染可快速的进行自然清除。本研究中两个与宫颈腺上皮病变有关的病例均为HPV18行单一亚型感染，符合大量研究表明的HPV18型与宫颈腺癌关系紧密的观点。

本研究结果还显示，导流杂交对HPV分型检测筛查宫颈病变具有较好的敏感度(95.30%)及阴性预测值(95.59%)。但本实验HR-HPV的特异度较低，仅为40.64%。美国2012年的ATHENA 实验应用cobas HPV检测≥CIN2的特异度为94.0%[18]；一项大样本实验结果显示应用荧光免疫PCR技术行HR-HPV分型检测特异度为85.76%[19]。本研究应用导流杂交得出的敏感度较高，特异度较低，可能因为HR-HPV检出只能说明患者感染了HR-HPV，而是否会发展为宫颈病变与HR-HPV持续感染的时间、HR-HPV的亚型、患者的自身免疫情况等多种原因密切相关，所以即使有HR-HPV的感染，组织病理学却未检出阳性病变结果。而且年轻妇女性生活频繁，病毒感染率高，但通常为一过性，可能导致敏感度较高、特异度较低。HR-HPV筛查的目的是发现当前有CIN2+病变或将来有可能发展为CIN2+的风险人群，而非检测单纯HR-HPV感染者。确保达到最大化的筛查益处和最小化的筛查潜在伤害。特异性太低会使假阳性率增加，更多的进行细胞学或阴道镜等检查，导致过度治疗，给患者带来精神和经济上过大的压力。

本文有7例HR-HPV假阴性结果，其中4例为宫颈癌，3例为CIN3。大量临床研究均指出在CC患者中有一定比例的样本中未见到HPV的感染：一项研究发现，9%的宫颈鳞状细胞癌HR-HPV基因分型检测是HPV阴性的[20]；另一项研究中发现，有9%～25%的鳞状细胞癌患者HPV测试结果为阴性[21]。HR-HPV假阴性的原因有以下几点：(1)病变较重，如微偏腺癌，胃和肠癌和中肾管癌及透明细胞癌[22]，因宫颈病变较重，组织细胞破坏严重，无法测出；(2)有未知的HR-HPV亚型，如HPV-90，一种罕见的基因型，在多达3.9%的高风险妇女中检测出来。在未来，某些以前被认为是“未知致癌潜能”或“低风险”的HPV基因型可能被确定为高危宫颈病变病原体；(3)取材不满意、HPV滴度和拷贝数低以至检测方法不能检出；(4)目前仍有小部分CC是与HR-HPV感染无关的。因此单用HPV检测筛查CC仍有部分的局限性。

综上所述，虽然导流杂交技术对于宫颈癌及癌前病变有较好的敏感度，但其特异度较低，容易造成不必要的过度治疗，并且HR-HPV有一定的漏诊率，为了在最大程度上准确的预防宫颈病变，减少宫颈癌的发生,应用导流杂交技术进行宫颈癌筛查时，应联合TCT等细胞学筛查进一步分流或者按照指南行联合筛查。

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本刊关于统计学处理的要求

关于资料的统计学处理：应根据实验或调查设计的条件，选用合适的统计学分析方法。对于定量资料，应正确选用t检验、q检验或方差分析；对于定性资料应选用卡方检验等。

统计结果的解释和表达：用概率P表达时，对比组之间的差异应叙述为：具有显著性(或非常显著性)意义。如差异具有显著性意义，P<0.05；差异具有非常显著性意义，P<0.01。而不应说“对比组之间具有显著性的(或非常显著性)的差异”。必要时，应写明所用统计分析方法的具体名称(如成组设计资料的t检验、两因素析因设计资料的方差分析、多个均数之间两两比较的q检验等)。统计量的具体值(如t=3.45,χ2=4.68,F=6.79等)应尽可能列出，当涉及到总体参数时最好给出95%置信区间。

Application of HybriMax human papillomavirus testing in cervical lesion screening

ZHANG Hui, XUE Bai, JIN Xian-yu

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,DalianMunicipalCentralHospital,Dalian116011,China)

Objective To evaluate the clinical efficacy of flow-through hybridization and gene chip (HybriMax) in cervical cancer and its precancerous lesion screening, and to discuss its feasibility as the prime initial screening methods. Methods Totally 7056 women received cervical lesion screening in Dalian Municipal Central Hospital during Dec 2013 to Dec 2015. The statistical data were analyzed. Infection status of different HR-HPV genotypes was investigated according to the results of HybriMax testing technology. And the effect of age on the HPV infection and the accuracy of high-level lesions (CIN2 and above) diagnosis were analyzed. The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of the CIN2 and above lesions using HybriMax testing were calculated and the feasibility of HybriMax testing as the prime initial screening methods was evaluated. We analyzed all the data using the SPSS 13.0, andP<0.05 had statistical significance. Results In 7056 women who received HybriMax, the HPV genotypes 16, 55 and 33 had the most close relationship with high-level cervical lesions (CIN2 or above), which were diagnosed pathologically and accounted for 70.86%(124/175)in all cervical lesions (CIN2 or above). The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of the CIN2 and above lesions using HybriMax testing are 95.30%, 40.64%, 39.01%, and 95.59%, respectively. Conclusion We should pay more attention on the middle-aged women because of the high HR-HPV infection rate. HybriMax test has great values in cervical cancer and its precancerous lesion screening with the high sensitivity and negative predictive value. However, as a screening method of cervical cancer, it should also be associate with the TCT or cytology diagnosis due to the low specificity and positive predictive value.

cervical lesions；HPV；HR-HPV-DNA testing；HybriMax；middle and old age

张 辉(1977-)，女，河北石家庄人，主治医师。E-mail:lznlwy963528@163.com

金仙玉，主任医师。E-mail:jinxy614@163.com

��著

10.11724/jdmu.2016.05.07

R714.45

A

1671-7295(2016)05-0444-06

2016-06-15；

2016-09-12)