三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量PCR应用中的比较

邵晓青，吕　申，冯　璐，李　梅

(1.大连医科大学附属第二医院 科研中心，辽宁 大连 116027；2.大连医科大学附属第一医院 病理科，辽宁 大连 116011)



三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量PCR应用中的比较

邵晓青1，吕申1，冯璐2，李梅1

(1.大连医科大学附属第二医院 科研中心，辽宁 大连 116027；2.大连医科大学附属第一医院 病理科，辽宁 大连 116011)

目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板，应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段，纯化回收产物，定量，并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释，作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real-time PCR仪指定试剂盒检测模板质量，再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增，每个浓度3复孔。标准曲线拟合，结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0.98(除1个样品为0.97)，10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0.8～1.0，2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2/3样品>1.2，而后两种染料为0.9～1.2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大，且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。

定量PCR；SYBR GreenⅠ；LC Green PLUS；EvaGreen

[引用本文]邵晓青，吕申，冯璐，等.三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量PCR应用中的比较[J].大连医科大学学报，2016,38(5)：428-431.

实时定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)是重要的生物、医学研究方法之一，广泛应用于mRNA、miRNA等基因表达定量分析，基因拷贝数变异(CNV)分析，线粒体DNA检测，基因甲基化分析，异源基因检测等[1-2]。探针法和染料法是进行实时定量PCR定量分析的两种基本方法。探针法虽然定量分析相对敏感，但荧光探针设计较复杂，依据目的片段序列不同有时需要设计多条探针进行条件优化，另外探针合成费用较高，探针保存条件要求比较严格。染料法无需探针合成，荧光染料较探针易于保存，价格也较低，因此在定量分析研究中染料法更受研究者青睐。

自1997年美国犹他大学C.T. Wittwer教授报道将不饱和DNA双链染料SYBR GreenⅠ用于实时定量PCR，染料法实时定量PCR技术迅速推广应用于各类生物、医学研究，SYBR GreenⅠ也成为定量PCR的标志性荧光染料[3]。但该染料对PCR反应有一定的抑制作用，染料浓度以及染料与反应体系组成，如各离子浓度等都需要繁琐和严格的优化，才能实现良好的定量分析目的[4]。因此，目前染料法定量PCR大多应用商家优化好的SYBR GreenⅠ定量试剂盒完成。这样虽然使实验操作变得简单，易于操作，但无疑也使实验设计缺少按需设计的灵活性。LCGreen PLUS、EvaGreen是常用于高分辨熔解曲线分析的饱和DNA双链荧光染料，国外有报道这两种染料可用于定量PCR，但国内尚缺乏相关研究。本研究应用三种荧光染料构建浓度梯度的定量标准曲线，通过统计学分析比较三者用于定量分析的差异。

1　材料和方法

1.1实时定量PCR标准曲线DNA模板制备

应用本实验室提取并保存的三个基因组DNA样品(S1，S2分别为非小细胞肺癌NCI-H1975，NCI-H2228细胞系gDNA，细胞系均购自南京科佰生物科技有限公司；S3为2008年大连医科大学附属第一医院手术切除肺癌癌旁肺组织，经病理学证实为非癌的肺组织的gDNA)为模板，上下游引物分别为：5′-TAAACTCCCGACCTCCAATG-3′和5′-CTGGACCCTCTATGGCTGAG-3′，PCR扩增G6PDH基因片段(960 bp)。PCR反应体系(20 μL)组成：Ex Taq®HS (TaKaRa)0.025 Ut/μL，1× Ex Taq Buffer，dNTP 200 μmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，gDNA模板5 ng。PCR反应条件为：98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，共50个循环。每个样品3复孔，琼脂糖凝胶(2%)电泳明确单一特异性条带，DNA纯化回收(GeneJETTMGel Extraction Kit，Fermentas)。应用Nanodrop2000(Thermo Scientific)测定浓度，并计算拷贝数。起始浓度为1.5×107拷贝数/μL，分别进行10倍和5倍连续7次梯度稀释，以1.5×103拷贝数/μL为起始浓度进行2倍连续7次梯度稀释，作为定量PCR标准曲线DNA模板。

1.2浓度梯度标准曲线定量PCR扩增和熔解曲线分析

应用Real-time PCR仪器(Roche: LightCycler®96)染料法定量启动试剂盒(含SYBGreen Ⅰ)，TaKaRa公司染料法定量试剂盒(含Ex Taq®HS 和SYBR Green Ⅰ)和应用TaKaRa公司Ex Taq®HS PCR试剂盒分别加入LCGreen Plus(BioFire Defense)和EvaGreen(Biotium)荧光染料进行定量PCR反应。反应体系按试剂盒推荐配制，以上述3个浓度梯度(10×，5×，2×)稀释好的DNA片段为模板(1 μL)，上下游引物各0.5 μmol/L(序列为：5′-GGAAAAGGAATGGCAGACAA-3′和5′-CCCCACAGTACATCGCTTTC-3′，产物长度76 bp)。LCGreen PLUS和EvaGreen均为0.5×。PCR反应条件(Roche试剂盒)为：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，共50个循环。TaKaRa试剂盒为：98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，共50个循环。反应体系10 μL，覆盖2滴石蜡油，每个样品浓度设3复孔。

所有样品，PCR反应结束后，都进行1次95 ℃ 10 s，65 ℃ 到97 ℃的熔解曲线检测。

1.3数据分析

数据采集，PCR反应效率，标准曲线线性拟合及误差估计等均应用LightCycler®96仪器自带分析软件(v1.1)完成。

2　结　果

2.1梯度稀释DNA片段模板质量检测

熔解曲线分析显示10倍和5倍稀释样品最高浓度(1.5×107拷贝数/μL)均有非特异性扩增，样品S2、S3的1.5×106拷贝数/μL浓度对10倍稀释定量标准曲线拟合优化有影响，样品S1的3.0×106拷贝数/μL浓度对5倍稀释定量标准曲线拟合优化有影响。模板DNA来源于细胞还是组织对定量标准曲线没有区别。去除10倍、5倍稀释1～2个最高浓度，以及各稀释梯度中由于加样误差导致的异常值复孔，各样品3个梯度稀释定量标准曲线都得到最佳优化，回归系数(R2)≥0.98(除了样品S1在2倍稀释标准曲线为0.97)，PCR反应效率为0.8～1。图1显示样品S1各梯度稀释的扩增曲线和定量标准曲线。

2.2三种荧光染料的定量扩增和熔解曲线分析

应用含SYBR GreenⅠ的定量试剂盒(TaKaRa)和与该试剂盒相同的Taq酶配制的含LC Green Plus、EvaGreen的定量PCR反应体系扩增3个DNA来源的3个梯度稀释全部样品。依据上述模板质量检测结果，去除相应10倍、5倍稀释的1～2个最高浓度，熔解曲线显示均为单一熔解峰的特异性扩增。去除各浓度复孔中的异常值，进行定量标准曲线计算。不同样品3个梯度稀释定量标准曲线计算结果见表1。

图1　样品S1的PCR扩增曲线和定量标准曲线(Roche试剂盒)Fig 1 Amplification curves and standard curves in sample S1 by 10-fold,5-fold,2-fold dilution (Roche kit)10-f、5-f、2-f分别为10倍、5倍和2倍三个浓度梯度稀释；不同颜色表示不同浓度，每个浓度3复孔

10-f斜率截距效率R25-f斜率截距效率R22-f斜率截距效率R2SYBRGreenⅠ S1-3.8334.700.830.99-3.5133.310.930.99-2.5032.201.510.98 S2-3.3732.850.980.99-3.6132.770.891.00-2.7332.791.330.97 S3-3.8735.120.930.99-3.8335.550.830.98-3.5133.880.930.99LCGreenPlus S1-3.6634.610.881.00-3.3933.410.971.00-3.0532.781.130.99 S2-3.3232.961.001.00-3.5733.600.911.00-3.5732.411.170.98 S3-3.4834.010.941.00-3.6535.290.880.98-3.3733.830.980.99EvaGreen S1-3.7334.710.851.00-3.4533.720.951.00-3.4434.120.950.98 S2-3.3732.990.980.99-3.6033.490.901.00-3.2232.721.040.99 S3-3.7035.070.861.00-3.7335.190.850.99-3.4733.690.940.99

三种荧光染料定量PCR在三个样品各梯度稀释的标准曲线的线性回归均系数均能在0.98以上(除了SYBR GreenⅠ试剂盒的样品S2)，10倍和5倍稀释的标准曲线计算得到的PCR反应效率在0.8～1.0， 而2倍稀释的标准曲线PCR反应效率略有差别：SYBR GreenⅠ试剂盒样品S1和S2反应效率>1.2，应用LCGreen PLUS和EvaGreen反应效率在0.9～1.2。由于上样误差导致异常Cq值的复孔在三种荧光染料定量试剂10倍、5倍梯度稀释标准曲线中都较少(不到所有上样数的5%)，但对2倍稀释标准曲线各染料试剂出现异常值的复孔数差异较大(3个样品共63个标准曲线上样点)：应用LCGreen PLUS试剂无异常复孔，应用EvaGreen共有6个，TaKaRa公司SYBR GreenⅠ试剂盒共有8个，Roche公司试剂盒共有16个。

2.3三种荧光染料定量扩增的标准曲线误差分析

三个样品不同荧光染料定量扩增的标准曲线由误差值和斜率获得的样品定量估计误差分布见图2，可以看出应用饱和荧光染料LCGreen PLUS和EvaGreen获得的标准曲线定量估计的误差较小，且样品间差异较小，而应用SYBR GreenⅠ的两种试剂盒样品间定量误差分散度较大(可达理论样品浓度的1.1～1.6倍)。另外，无论应用哪种荧光染料试剂，样品定量检测误差有随标准曲线样品间梯度稀释增大而减小的趋势。

图2　不同染料试剂盒标准曲线估计误差造成的样品定量浓度误差分布Fig 2 The distribution of concentration ratio (error concentration/theory concentration) among different dyes 纵坐标为Cq误差值造成的定量浓度误差与理论浓度比值，横坐标为不同染料，其中SYB(R)为Roche试剂盒，SYB为TaKaRa试剂盒；不同梯度稀释如图例

3　讨　论

染料法荧光定量PCR操作简便、快速、检测灵敏度高，广泛用于生物、医学等科研的核酸定量分析中。但是从样品保存处理、核酸提取、反转录效果、引物设计和选择、定量PCR体系、条件优化到数据分析等多方面的处理不当都能影响核酸定量分析结果的准确性，以至于不同实验室报道的结果出现较大偏差，甚至完全相反。为了得到可靠的结果，减少实验室之间数据偏差，欧美等多国2009年联合发布了针对qPCR实验的指南(The MIQE Guidelines)，用以规范qPCR实验设计、实验具体过程、数据分析和文章报道。目前，该指南已经成为qPCR实验数据发表的规范[5]。

染料法qPCR定量也有自身局限性。即使引物设计，PCR条件等关键环节都得到最佳优化，样品间上样误差、随机误差也是导致定量敏感性下降的重要原因。根据泊松分布概率计算，理论上，95%概率能检测检测到模板(limit of detection, LOD)至少需要3个拷贝[6]。模板拷贝数过高，会导致PCR抑制，非特异性扩增的增加等，如本实验中梯度稀释最高浓度在应用Roche试剂盒扩增时，均出现了非特异性扩增。因此实验前对含有待测片段的模板拷贝数初步估计是保证定量检测灵敏性和特异性的必要环节。由于随机误差导致每次上样模板拷贝数的差异会造成定量结果的误差，通过增加实验重复次数可以尽可能提高检测敏感性，例如对于一般95%可信区间的定量结果，如果从2个拷贝中定量得到1个拷贝差异至少需要4～5次重复，从4个拷贝中定量得到3个拷贝差异至少需要11～12次重复[7]。对于实验不能达到一定重复次数时，只能牺牲检测灵敏度。按标准曲线回归系数和PCR效率评估三种荧光染料试剂获得的不同浓度梯度稀释标准曲线基本都能满足一般定量要求，但标准曲线回归的误差分布有所不同，根据回归标准曲线的各自误差值和斜率可以得到因为误差造成的样品定量产生的误差。本次实验应用3次重复(3复孔)制作标准曲线，去除异常Cq值复孔，定量估计误差达到理论值的1.1～1.6倍。应用LCGreen PLUS和EvaGreen做定量时，误差有所减低，但还需要增加实验重复次数进一步验证。

不同于SYBR GreenⅠ，LCGreen PLUS和EvaGreen都是饱和双链DNA荧光染料，常用于高分辨熔解曲线基因变异扫描(gene mutation scan)和基因分型(genotype)分析[8-9]。因为对PCR没有抑制作用，这两种染料可以根据具体引物，待扩增目的片段序列实际情况自由调整优化反应体系，不受染料干扰的限制。本实验结果表明LCGreen PLUS和EvaGreen可用于qPCR的定量分析，而且样品间定量均一性，异常复孔出现频率均优于SYBR GreenⅠ试剂盒。

[1] Bernard PS, Wittwer CT. Real-time PCR technology for cancer diagnostics[J]. Clin Chem, 2002，48(8):1178-1185.

[2] Chong GL, van de Sande WW, Dingemans GJ,et a1.Validation of a new Aspergillus real-time PCR assay for direct detection of Aspergillus and azole resistance of Aspergillus fumigatus on bronchoalveolar lavage fluid[J]. J Clin Microbiol, 2015，53(3):868-874.

[3] Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, et al. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification [J]. Biotechniques, 1997, 22(1): 130-131, 134-138.

[4] Gundry CN, Vandersteen JG, Reed GH, et a1. Amplicon melting analysis with labeled primers: a closed-tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes [J]. Clin Chem, 2003, 49(3): 396-406.

[5] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments [J]. Clin Chem, 2009, 55(4): 611-622.

[6] Huggett JF, Foy CA, Benes V, et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments[J]. Clin Chem, 2013，59 (6):892-902.

[7] Weaver S, Dube S, Mir A, et al. Taking qPCR to a higher level: analysis of CNV reveals the power of high throughput qPCR to enhance quantitative resolution [J]. Methods，2010，50 (4):271-276.

[8] Wittwer CT, Reed GH, Gundry CN, et al. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen[J]. Clin Chem, 2003，49(6):853-860.

[9] Li M, Zhou L, Palais RA,et al.Genotyping accuracy of high-resolution DNA melting instruments[J]. Clin Chem, 2014，60(6):864-872.

Comparison of SYBR GreenⅠ, LCGreen PLUS, EvaGreen in quantitative real-time PCR

SHAO Xiao-qing1, LV Shen1, FENG Lu2, LI Mei1

(1.ScientificResearchCenter，theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116027，China; 2.PathologyDepartment,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116011)

Objective To compare with SYBR GreenⅠ, LCGreen PLUS, EvaGreen in quantitative real-time PCR (qPCR). Methods Large G6PDH fragment (960 bp) was amplified from 3 gDNA samples by nest PCR. PCR products were purified and quantified, then diluted 7 times with 10-, 5-, 2-fold as the templates of qPCR. The quality of templates was tested with qPCR kit of Roche, which is the start kit of the qPCR instrument.Short G6PDH fragment (76 bp) was amplified by qPCR with the same Taq enzyme and different dye, SYBR GreenⅠ, LCGreen PLUS, EvaGreen respectively. Commercial software was used to analyze data.Results R2of all standard curves from 3 dyes were equal or more than 0.98 (0.97 in a sample). PCR efficiency of 10-fold and 5-fold dilution standard curve were 0.8-1.0 in all 3 dyes. PCR efficiency of 2-fold dilution was spacemore than 1.2 in 2/3 samples with SYBR GreenⅠ, while 0.9-1.2 in all others.The estimate error in standard curve with SYBR GreenⅠwas larger and more dispersed than in those with other two dyes.Conclusion Saturated dye, LCGreen PLUS and EvaGreen may be better in quantity of qPCR.

quantitative real-time PCR (qPCR); SYBR GreenⅠ;LC Green PLUS; EvaGreen

国家自然科学青年基金项目(81501832)；国家自然科学基金面上项目(81572919)；辽宁省教育厅一般项目(L2015144)

邵晓青(1990-)，女，山东威海人，硕士研究生。

李 梅，副主任医师。E-mail：rosemaryli80@163.com

��著

10.11724/jdmu.2016.05.03

R331

A

1671-7295(2016)05-0428-04

2016-06-27；

2016-09-09)