反常性痤疮一家系调查及致病基因突变分析

张晓峰 苏惠春 覃云飞 李诚让 肖学敏 徐浩翔 王宝玺

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所皮肤科（张晓峰、苏惠春、李诚让、肖学敏、徐浩翔、王宝玺）；南宁市第二人民医院皮肤科（覃云飞）

反常性痤疮一家系调查及致病基因突变分析

张晓峰 苏惠春 覃云飞 李诚让 肖学敏 徐浩翔 王宝玺

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所皮肤科（张晓峰、苏惠春、李诚让、肖学敏、徐浩翔、王宝玺）；南宁市第二人民医院皮肤科（覃云飞）

目的研究一个反常性痤疮家系患者γ分泌酶基因突变情况。方法收集1个反常性痤疮患者家系资料，该家系共4代30人，患者12例，其中在世患者9例。提取先证者及其有关亲属8例（患者5例、非患者3例）外周血DNA，采用PCR扩增NCSTN、PSEN1、PSENEN、Aph1基因编码区的全部外显子及其侧翼序列，测序并分析。选取100例健康人作为对照。结果基因检测发现，5例患者外周血DNA中的PSENEN基因发生c.229_230insCACC插入突变，导致氨基酸翻译过程中移码，不能形成功能正常的PSENEN蛋白，家系中3例正常亲属及100例健康对照均无该突变。结论反常性痤疮家系存在1个新的插入突变，即PSENEN c.229_230insCACC突变，可能是引起该家系反常性痤疮患病的分子机制。

突变；基因，PSENEN；反常性痤疮；γ分泌酶

反常性痤疮（ance inversa，AI）发病机制不明确，患者中有30%～40%有家族史，该病以常染色体显性方式遗传，伴不完全外显［1］。2010年，王宝玺等［2］首次报道了γ分泌酶不同亚基的突变可导致家族性AI。γ分泌酶是一个膜内切蛋白酶复合体，包括Nicastrin（NCSTN）、早老素1（PSEN1）、早老素增强子2（PSENEN）、前咽缺陷蛋白（Aph1）4种组分［3］，其中，NCSTN、PSEN1、PSENEN突变可导致家族性AI［2］。随后，多个研究报道了AI患者的γ分泌酶基因突变［4⁃8］。我们通过PCR扩增及碱基测序，首次报道1个PSENEN突变的AI家系。

一、家系调查

现场调查1个来自广西的反常性痤疮家系，该家系共4代30人，患者12例，其中在世患者9例。检测突变的家族成员8例，其中先证者（Ⅲ7）及Ⅱ7、Ⅲ1、、Ⅲ6、Ⅲ12为患者，Ⅱ5、Ⅲ8、Ⅳ5为正常亲属（图1）。先证者，男，52岁，30余年前患者逐渐出现面、颈、腋窝、臀部、腹股沟等毛囊性丘疹、结节、脓肿，并逐渐形成窦道及瘢痕，未规律治疗，皮损迁延不愈。家族中多人出现类似症状，轻重不一。体检：头皮、臀部脓肿、窦道，面部、腋窝、臀部瘢痕（图2）。否认系统性疾病，父亲有类似皮损，已去世，父母非近亲结婚，家族内多人有类似皮损。

二、方法

1.基因组DNA提取：抽取5例患者及其3例亲属外周血2 ml，提取基因组DNA（DNA Blood Mini试剂盒，51104，德国Qiagen公司）。同时在数据库中随机选择100例无关健康人基因组DNA作对照。本研究通过中国医学科学院皮肤病研究所医学伦理委员会批准，患者及亲属均签署知情同意书。

2.PCR引物设计：根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库提供的 NCT、PSEN1、PSENEN序列，利用Primer5软件设计特异性引物，扩增先证者NCT、PSEN1、PSENEN基因编码区全部外显子及其侧翼序列，引物由上海立菲生物技术有限公司合成。

3.PCR反应及测序：PCR反应体系50 μl，含基因组DNA 1 μl，上下游引物各1 μl（20 mmol/L），使用Progema GoTaq® Green Master Mix（2 ×）25 μl，ddH2O 22 μl。反应条件：95 ℃预变性3 min后，进行以下14个循环：95℃变性35 s，63℃退火45 s（第2循环起每个循环以后退火温度降低0.5℃），72℃延伸75 s，接着进行26个循环：94℃ 变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸75 s，共40个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析，PCR产物纯化后由上海立菲生物技术有限公司完成测序。所有测序结果用NCBI blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）等数据库进行分析比对。

三、结果

1.AI患者临床表现分析：先证者（Ⅲ7）皮损范围最大，脓肿及瘢痕最多，腋窝皮损较重（图2）。病情最轻的是Ⅲ12，仅有少量毛囊性丘疹（图3）。其余患者病情严重程度介于Ⅲ12和Ⅲ7之间。

图1 反常性痤疮家系图 *为检测基因突变者

图4 DNA测序结果 PSENEN c.229_230insCACC（箭头处为突变碱基位点）

2.AI患者基因突变分析：以先证者基因组DNA为模板，根据上述条件PCR扩增出NCSTN、PSENEN、PSEN1基因所有外显子的编码序列及侧翼序列。突变分析比对发现PSENEN基因第4外显子插入CACC 4个碱基，即出现插入突变PSENEN c.229_230insCACC（p.I77HfsX45）（图 4），导 致PSENEN翻译中产生移码，在突变下游45个密码子处终止翻译。另4例患者均存在该突变，而3例非患者（Ⅱ5、Ⅲ8、Ⅳ5）不具有该突变，在100例健康对照中也不存在。

四、讨论

AI又称为毛囊闭锁三联征，三联征指的是聚合性痤疮、化脓性汗腺炎和头皮脓肿性穿掘性毛囊周围炎同时出现。但临床观察发现，只有少部分AI患者同时具有三联征的临床表现，皮损较多累及腋下、乳房下、腹股沟、外生殖器及肛周等顶泌汗腺分布密集的部位。而且，AI发病年龄与寻常痤疮相似，但病程、好发部位、皮损特点等与寻常痤疮有明显差异，故近年来较多学者建议以“反常性痤疮”代替“毛囊闭锁三联征”。PSENEN蛋白是γ分泌酶的亚基之一，PSENEN亚基具有3个跨膜片段（transmembrane segment，TM），其不同功能域分别与PSEN1和NCSTN相互作用，促进γ分泌酶PSEN1亚基的催化作用并协助γ分泌酶复合体的组装［3］。PSENEN蛋白的功能障碍可能影响γ分泌酶的活性及功能并产生相应效应。近年来，γ分泌酶突变的AI家系报道并不少见，但大多数突变位于NCSTN亚基，PSENEN突变的家系报道较少［2，5］。对于突变患者的临床表型，有研究报道，NCSTN突变的AI患者皮损主要出现在面部、颈后、背部、臀部等非典型部位，腋窝皮损较轻［2］，存在NCSTN或PSENEN突变的患者颈后部更易出现皮损［9］。本家系中，各患者之间病情轻重变化大，该家系中先证者腋窝、颈后的各个部位皮损均较严重，但其他患者腋窝、颈后皮损较轻，故具有PSENEN突变的AI患者皮损特点是否与NCSTN突变的AI患者存在相关性，尚需收集更多PSENEN突变的AI家系进一步研究。对于PSENEN突变家系的突变位置，既往报道的突变集中于PSENEN基因第3、4外显子，均为插入缺失碱基引起移码突变，其中2例突变位点为相邻碱基PSENEN基因编码区第66、67碱基处，提示该位置为热点突变区域，相应位点翻译的氨基酸区域可能为重要功能域。本文家系报道的突变同样为PSENEN的第4外显子上的移码突变，编码区第229位碱基后插入CACC 4个碱基，使得PSENEN翻译时产生移码，不能形成正常的PSENEN蛋白，导致蛋白功能障碍，进而可能引起γ分泌酶复合体功能受到影响，造成下游相关信号转导通路的级联反应，产生一系列效应，这可能是AI发病的分子机制之一。另外，该突变位于TM3中，该区域氨基酸疏水基团恰好是PSENEN与PSEN1的相互作用的重要区域［3］，提示该位置发生突变后可能影响PSENEN与PSEN1的相互作用。

［1］ Revuz J.Hidradenitis suppurativa［J］.Presse Med,2010,39（12）:1254⁃1264.DOI:10.1016/j.lpm.2010.08.003.

［2］ Wang B,Yang W,Wen W,et al.Gamma⁃secretase gene mutations in familial acne inversa［J］.Science,2010,330（6007）:1065.DOI:10.1126/science.1196284.

［3］ Bai XC,Yan C,Yang G,et al.An atomic structure of human γ⁃secretase［J］.Nature,2015,525（7568）:212⁃217.DOI:10.1038/nature14892.

［4］ Zhang C,Wang L,Chen L,et al.Two novel mutations of the NCSTN gene in Chinese familial acne inverse［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2013,27（12）:1571 ⁃1574.DOI:10.1111/j.1468⁃3083.2012.04627.x.

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［8］焦婷,韩长元,张力,等.反常性痤疮一家系临床表型及基因突变研究［J］.中华皮肤科杂志,2014,47（11）:814⁃815.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2014.011.015.Jiao T,Han CY,Zhang L,et al.Clinical and genetic analysis of a pedigree with acne inversa［J］.Chin J Dermatol,2014,47（11）:814⁃815.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2014.011.015.

［9］ Wang B.γ⁃secretase mutation and consequently immune reaction involved in pathogenesis of acne inversa［J］.J Investig Dermatol Symp Proc,2015,17（1）:25.DOI:10.1038/jidsymp.2015.21.

Acne inversa in a family:a clinical survey and genetic mutation analysis

Zhang Xiaofeng,Su Huichun,Qin Yunfei,Li Chengrang,Xiao Xuemin,Xu Haoxiang,Wang Baoxi
Department of Dermatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042，China（Zhang XF,Su HC,Li CR,Xiao XM,Xu HX,Wang BX）;Department of Dermatology,Second People′s Hospital of Nanning City,Nanning 530031,China（Qin YF）

ObjectiveTo analyze γ ⁃secretase gene mutations in a pedigree with acne inversa.MethodsClinical data were collected from a pedigree with acne inversa,which contained 30 members spanning 4 generations.Of these members,12 were affected by acne inversa,and 9 of the affected members were alive.Peripheral blood DNA was obtained from the proband,his seven relatives（including 4 affected and 3 unaffected members）,and 100 unrelated healthy human controls.PCR was performed to amplify all the coding exons and their flanking sequences of the NCSTN,PSEN1,PSENEN,Aph1 genes followed by DNA sequencing.ResultsA heterozygous insertion mutation（c.229_230insCACC）of the PSENEN gene,which led to translational frameshifting and resulted in dysfunciton of the PSENEN protein,was detected in all the 5 patients,but not in unaffected members or healthy controls.ConclusionThere is a novel heterozygous insertion mutation c.229_230insCACC in the PSENEN gene,which may be the molecular basis of acne inversa in this family.

Mutation;Genes,PSENEN;Acne inversa;gamma⁃Secretase

Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

王宝玺，Email：wangbx@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.07.016

国家自然科学基金（81101207、81472905、81472872）；北京协和医学院协和青年基金（33320140136）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81101207,81472905,81472872）;PUMC Youth Fund（33320140136）

2015⁃09⁃02）

（本文编辑：吴晓初）