武当山区不同品种重楼地上部分总黄酮含量比较研究

杨金霞，朱敏，叶方，陈黎，黄良永，孙良学，雷攀

（1.湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院，湖北十堰442000；2.湖北医药学院湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心，湖北十堰442000；3.湖北济世药业有限责任公司，湖北十堰442000）

武当山区不同品种重楼地上部分总黄酮含量比较研究

杨金霞1，2，朱敏2，叶方1，2，陈黎1，2，黄良永1，2，孙良学3，雷攀1，2

（1.湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院，湖北十堰442000；2.湖北医药学院湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心，湖北十堰442000；3.湖北济世药业有限责任公司，湖北十堰442000）

目的建立测定武当山区不同品种野生转家种重楼地上部分总黄酮含量的荧光分光光度法。方法以芦丁为对照品，激发波长445 nm、发射波长484 nm、狭缝宽度2.5 nm，测定总黄酮含量。结果与结论不同品种重楼地上部分总黄酮含量差异较大，其中多叶重楼含量较高，滇重楼最低，宜选择多叶重楼地上部分进行开发利用。

重楼；总黄酮；野生转家种；地上部分

重楼为百合科Liliaceae重楼属Paris L.多年生草本植物，又名蚤休、七叶一枝花、草河车，具有消肿止痛、抗癌、清热解毒和止血等作用，广泛用于多种中药制剂中，是宫血宁、红药、热毒清等重要中成药的主要成分。重楼为多年生草本，对生长环境要求较为苛刻，适合生长在海拔600～3 100 m、雨量充沛、气候凉爽、腐殖质丰富的环境下［1］。武当山区地理气候环境独特，适于重楼等药用植物的生长［2］。黄酮类成分对心血管、抗肝损伤、解痉、呼吸系统可起良好作用，有雌激素样作用，可抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化作用，在医药、食品保健等方面已被广泛应用［3-4］。重楼的传统用药部分为地下根茎，而地上部分常弃去，造成资源浪费。本研究中测定并比较了重楼不同品种间地上部分总黄酮含量的变化，以期为重楼地上部分资源的合理利用提供参考。

1　仪器与试药

1.1仪器

日立F-7000型荧光光谱仪；FA-2004型电子分析天平（上海精密仪器）；PHSJ-A型数字式酸度计（上海雷磁仪器）；HW1A型电热恒温水浴箱（北京医疗设备厂）。

1.2试药

芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100080-201408，含量92.8%）；重楼药材采自武当山区马家河龙王寨，原药材地上部分洗净，50℃烘干，粉碎过3号筛备用，由湖北医药学院药学院叶方副教授鉴定，样本保存在湖北医药学院附属十堰市太和医院药学部标本室，见表1。无水乙醇、石油醚、硝酸铝、醋酸钠、冰乙酸均为分析纯；水为自制去离子水。

表1　样品基源信息及含量测定结果

2　方法与结果

2.1溶液制备

精密称取10.3 mg芦丁对照品于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶液定容至刻度，得对照品溶液。

精密称定不同品种及不同采收期重楼的地上部分干燥粉末1.0 g，置100 mL锥形瓶中，加入25 mL石油醚，放入60℃恒温水浴锅水浴回流2 h，弃石油醚液后将药渣挥干，加入30 mL 60%乙醇，再放入80℃恒温水浴锅回流2 h，滤过，用60%乙醇将容器和药渣冲洗3次，合并滤液，转移至50 mL容量瓶中，加入60%乙醇定容至刻度［5］，得到供试品溶液A1～A12。

2.2检测波长选择

精密量取芦丁对照品0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加入1 mL 10%硝酸铝溶液及3 mL pH=4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液后，加60%乙醇定容至刻度［6］，摇匀，放置25 min［7］。精密量取A1样品溶液0.5 mL，置10 mL容量瓶中，同上述操作。取上述对照品及供试品溶液进行激发光谱（λex）和发射光谱（λem）波长扫描：固定λex，扫描λem在200～700 nm波长范围内芦丁对照品及供试品溶液荧光强度，结果最佳λem为484 nm。见图1A和图1B。固定λem为484，扫描λex在200～700 nm范围内芦丁对照品及样品溶液荧光强度，结果最佳λex为445 nm，见图1C和图1D。本试验选择确定荧光条件为：λex为445 nm，λem为484 nm，狭缝宽度为2.5 nm。

2.3方法学考察

图1　荧光分光光度色谱图

线性关系考察：精密吸取芦丁对照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入10%硝酸铝溶液1 mL，pH=4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液3 mL，加60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置25 min。按拟订荧光条件对标准溶液进行荧光强度检测；以60%乙醇溶液作空白，同法操作，测定吸光度值。以标准品溶液质量浓度（μg/mL）为横坐标，Δ吸光度值（吸光度值-空白）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.019 0 X+0.038 5，R2=0.996 8（n=6）。结果表明，芦丁质量浓度在2.06～32.96 μg/mL范围内与荧光强度呈良好的线性关系。

重复性试验：精密称取7号药材粉末1 g，共6份，分别精密吸取0.5 mL置10 mL容量瓶中，按2.3项下方法与硝酸铝显色后，在拟订荧光法条件下测定光度值，计算总黄酮含量。结果样品平均含量为0.59%，RSD值为2.13%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，按2.3项下方法显色后，在拟订荧光条件下测定光度值，在0，0.5，1.0，1.5，2.0 h时测定吸光度。结果的RSD为1.28%（n=5），表明供试品溶液在2 h内稳定性良好。

精密度试验：精密吸取1 mL芦丁对照品溶液置10 mL容量瓶中，按2.3项下方法显色后，在拟订荧光条件下连续测定光度值。结果5次光度值数据的RSD值为1.97%（n=5），表明仪器精密度良好。

加样回收试验：精密称取同一批次7号药材粉末0.5 g，共计6份，按2.2项下方法用石油醚除去叶绿素后，分别精密加入5 mL芦丁对照品溶液质量浓度为0.612 0 g/L，加60%乙醇回流提取后过滤，药渣冲洗3次，合并滤液至50 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，按2.3项下方法显色，在拟订荧光条件下测定吸光度值，计算加样回收率。结果见表2。

表2　加样回收试验结果（n=6）

2.4样品含量测定

在拟订荧光条件下，按2.3项下方法与硝酸铝显色后，测定样品中总黄酮的光度值，计算样品中总黄酮的含量。结果见表1。

3　讨论

重楼是多年生药用植物，块茎繁殖需4～5年采收，种子繁殖需要8～9年采收，生长周期较长。人工种植重楼时，为了让养分集中供应根茎部位以利生长，一般在5～6月花萼片展开后，及时剪去全部花花薹，以提高产量［8-9］。如此一来地上部分均被浪费，在野生资源日趋紧张的大环境下，有必要开展药材新资源的研究［10］。由表可知，武当山区家种多叶重楼地上部分总黄酮含量高，建议取多叶重楼地上部分为原料提取黄酮，以扩大其临床用药的药源的经济意义。

品种选择：由表1可知，不同品种重楼地上部分总黄酮含量差异较大。其中多叶重楼、宽叶重楼、狭叶重楼总黄酮含量较高，华重楼、滇重楼含量较低。2015年版《中国药典（一部）》规定，华重楼和滇重楼为正品重楼，以重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ4种成分作为质量控制指标，前期研究证明华重楼和滇重楼中皂苷含量较高，多叶重楼、宽叶重楼中皂苷类成分较低，表明重楼中黄酮类成分与皂苷类成分可能存在负相关，建议宜选用多叶重楼、宽叶重楼等品种开发重楼中黄酮类成分。

荧光分光光度法测定总黄酮含量：根据黄酮类化合物能与铝离子反应形成荧光螯合物的原理，可采用荧光光度法测定药用植物中总黄酮的含量［7］。本研究中尽管在样品处理过程中采用石油醚去除叶绿素，但可能还是会干扰对黄酮含量的测定。采用硝酸铝在酸性条件下与样品中黄酮类成分产生荧光物质的原理，用荧光分光光度法测定总黄酮含量，专属性高。

［1］年四辉，刘丽敏.重楼地上部分初步开发实验研究［J］.云南中医中药杂志，2007，28（4）：35-36.

［2］叶方，胡培，杨光义，等.湖北武当山地区重楼资源调查［J］.中药材，2015，38（8）：1 615-1 617.

［3］唐栩，许东晖，梅雪婷，等.26种黄酮类天然活性成分的药理研究进展［J］.中药材，2003，26（1）：46-54.

［4］任珊珊，包保全，毛婷，等.中药中总黄酮的含量测定方法研究进展［J］.北方药学，2015，12（3）：112-116.

［5］黄锁义，龙凤，梁宇，等.荧光光度法测定榕树叶总黄酮含量的研究［J］.时珍国医国药，2006，17（6）：983-984.

［6］马登磊，邵建群，何深知，等.荧光分析法测定元宝枫叶中总黄酮含量的研究［J］.首都医科大学学报，2014，35（1）：113-117.

［7］邵菊芳，温宗壮，朱红威，等.基于荧光光谱法对银杏黄酮糖苷的检测研究［J］.光谱学与光谱分析，2013，33（11）：3 055-3 060.

［8］杨斌，李绍平，王馨，等.滇重楼的栽培与合理利用［J］.中国野生植物资源，2008，27（6）：70-73.

［9］梅中青，梅益丽.七叶一枝花野生变人工栽培的技术研究［J］.中国中药杂志，2004，29（12）：1 213-1 214.

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Comparative Study on Content of Total Flavonoids from the Aerial Parts of Different Varietals Paris from WuDang M ountain Area

Yang Jinxia1，2，Zhu Min2，Ye Fang1，2，Chen Li1，2，Huang Liangyong1，2，Sun Liangxue3，Lei Pan1，2
（1.Shiyan Taihe Hospital·Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China442000；2.Engineering Research Center for Herbal Utilization of Hubei Province，Hubei University of MedicineHubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China442000；3.Hubei Jishi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shiyan，Hubei，China442000）

ObjectiveTo compare the content of total flavonoids from the aerial parts of different varietals Paris from WuDang mountain area.M ethodsRutin was used as contrast calibre，for the excitation wavelength of λex=445 nm，emission wavelength of λem=484 nm，slitwidth 2.5nm，and contentof totalflavonoidswasdetermined by usingfluorescencespectrophotometricmethod.Resultsand ConclusionThe content of total flavonoids in the aerial parts of different varietals Paris varied in different regions，and it was the highest in Paris polyphylla Sm.，and was lowest in Paris polyphylla Sm.var.yunnanensis.To exploit and use the aerial parts，it is better to select the Paris polyphylla Sm.

Paris；total flavonoids；cultivated from wild；aerial parts

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2016）15-0016-03

湖北省2011计划，项目编号：4；2014年湖北省中青年创新团队项目，项目编号：T201414；湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心项目，项目编号：GC2015204。

杨金霞（1974-），女，大学本科，主管药师，研究方向为医院药学，（电子信箱）236172734@ qq.com；陈黎（1973-），女，博士研究生，主任药师，主要从事医院药事管理与中药研发工作，本文通讯作者，（电子信箱）chenli0201@sina.com。

（2016-04-22）