中药川芎心肌缺血保护作用的谱效学研究

刘旭，程艳芹，崔晓博，李明春

（中国人民解放军第401医院药剂科，山东青岛266071）

中药川芎心肌缺血保护作用的谱效学研究

刘旭，程艳芹，崔晓博，李明春

（中国人民解放军第401医院药剂科，山东青岛266071）

目的以大鼠心肌缺血模型为对象，研究中药川芎对大鼠心肌缺血保护作用谱效关系及药效物质基础。方法建立中药川芎液相指纹图谱分析方法，以结扎大鼠冠状动脉致急性心肌缺血模型，运用多元回归分析、双变量相关分析，将川芎提取物药效数据与指纹图谱的共有峰的相对峰面积相关联，分析药物治疗心肌缺血作用的物质基础和谱效关系。结果藁苯内酯、川芎内酯、阿魏酸、川芎嗪均与药效呈显著正相关，其中阿魏酸、川芎嗪可显著降低血清中丙二醛（MDA）等的升高，可显著升高血清超氧化物歧化酶（SOD）活力，均为中药川芎治疗心肌缺血的主要有效成分。结论通过谱效关系研究获得了药效活性物质，建立了川芎药材谱效关系评价的方法，客观反映了药物内在质量，为该类中药的创新研究提供了借鉴。

川芎；指纹图谱；谱效关系；阿魏酸；川芎嗪

川芎为伞形科植物川芎Ligusticum Chuanxiong Hort.的干燥根茎，性温，味辛，具有祛风止痛、活血行气的功效，对心肌缺血损伤有保护作用，含有生物碱、酚类、内酯类、挥发油、有机酸等多种成分［1］。川芎成分复杂，药效物质难以确定，采用能表征中药信息的指纹图谱分析，以及药物活性物质与指纹图谱的谱效模型，可客观体现中药川芎的总体质量水平［2-3］。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法建立了川芎药材的指纹图谱，运用大鼠心肌缺血模型，从血清酶学范畴研究指纹图谱，对其药效物质进行评价筛选；通过统计学方法，将活性成分特征峰的指纹图谱与药效结果相对应，通过建立谱效相关性研究模型，客观反映了中药川芎的内在质量，为该类中药的质量控制和药效评价提供了依据［4-5］。

1　仪器、试药与动物

1.1仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（包括四元泵，1100色谱工作站，Agilent公司）；SC-M5型麻醉呼吸机（上海医疗仪器厂）；LD5-2A型离心机（北京医用离心机厂）。1.2试药

川芎药材由山东大学药学院生药教研室范培红副教授鉴定确认。对照品阿魏酸（批号为905-201115，纯度为99.0%），川芎嗪（批号为0803-201112，纯度为99.0%），藁苯内酯（批号为0708-201110，纯度为99.0%），川芎内酯A（批号为1006-201201，纯度为99.0%），均购自中国药品生物制品检定所；乙腈（色谱纯，Merck KGaA公司，64271 Darmstadt）。复方丹参滴丸（天津天士力制药股份有限公司，批号131020）。超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号为20130825），丙二醛（MDA）试剂盒（批号为20130810），以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3动物

健康SD大鼠（Rattus norvegicus），30只，雌雄兼备，体重310～350 g，购自青岛市药检所实验动物中心，实验动物合格证号码为2013A030。饲养条件：温度24℃，相对湿度50%，保持通风。

2　方法与结果

2.1指纹图谱的建立

2.1.1色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-1%冰乙酸水溶液（B），梯度洗脱，10 min（10∶90）→20 min（20∶80）→30 min（30∶70）→60 min（30∶70）；流速：1 mL/min；柱温：室温；检测波长：322 nm；灵敏度：0.1 AUFS。拟订色谱条件下，川芎中阿魏酸、川芎嗪、藁本内酯、川芎内酯A均达到基线分离，与相邻色谱峰的分离度＞1.5，拖尾因子均在0.90～1.10。理论板数按川芎嗪、阿魏酸峰计算不低于4 500，峰对称因子符合《中国药典（一部）》要求。色谱图见图1。

2.1.2溶液制备

供试品溶液：精密称取川芎药材粗粉（过40目筛）约100 mg，精密称定，置10 mL棕色量瓶中，精密加入0.1 mL冰醋酸后，加入90%甲醇稀释至刻度，经预实验筛选实验条件，超声处理18 min，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，滤取澄清液，得供试品溶液。

图1　高效液相色谱图

对照品溶液：精密称取各对照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加入90%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3指纹图谱测定

精密称取供试品溶液20 μL，注入HPLC仪，记录60 min色谱图。川芎嗪是该药物中含量较多且最稳定的峰，故选择川芎嗪为参照峰（S），以其保留时间和色谱峰峰面积积分值为1，计算其他峰的保留时间和峰面积积分值与基准峰的保留时间和峰面积积分值之比。

2.1.4方法学考察

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，2 h内重复进样5次，测定HPLC色谱图。结果各共有峰相对峰面积的RSD均小于1.00%（n=5），相对保留时间的RSD均小于0.80%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取川芎供试品溶液，分别放置0，2，4，6，8 h时测定。结果峰面积的RSD均小于1.50%（n=5），相对保留时间的RSD均小于0.90%（n=5），表明供试品溶液在8 h内稳定。

重复性试验：平行取同一供试品5份，1 d内测定HPLC色谱图。结果各共有峰相对峰面积的RSD均小于1.00%，相对保留时间的RSD均小于0.85%（n=5），表明方法重复性好。

2.1.5指纹图谱

依法测得10批药物的指纹图谱，在相同的保留时间有峰出现，川芎内酯A的保留时间为8.45 min，藁本内酯为15.01 min，川芎嗪为19.56 min，阿魏酸为25.79 min。在拟订色谱条件下检测，指纹图谱见图2。选择指纹图谱中包括上述4个色谱峰在内的6个峰作为考察指标，其相对保留时间的RSD为0.60%～0.90%，相对峰面积积分值比值的RSD为1.00%～2.65%。

图2　川芎提取物指纹图谱

2.2对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用

2.2.1建模

将SD大鼠随机分为6组，每组8只，即模型组、假手术组、川芎提取物组（50 mg/kg，A1组）、川芎提取物组（100 mg/kg，A2组）、川芎提取物组（200 mg/kg，A3组）、阳性对照组（复方丹参滴丸50 mg/kg）。各组均灌胃给药，连续给药7 d，其中假手术组和模型组给予等剂量的生理盐水，在7 d灌胃后45 min进行冠状动脉结扎手术。手术方法：20%乌拉坦（1 g/kg）麻醉，仰位固定，气管插管并接好人工呼吸机，呼吸频率大约为55次/分；以ECGⅡ导联S-T段明显抬高或T波高耸作为结扎成功标志［6-7］；缺血30 min后恢复冠脉血流120 min，腹主动脉取血，取心脏。

2.2.2指标检测

腹主动脉取血后，2 000 r/min离心10 min，取血清。按试剂盒操作说明测定血清SOD活性、MDA含量。

2.2.3对大鼠血清中SOD和MDA含量的影响

模型组MDA含量明显增加，SOD的活力显著降低，与假手术组比较有显著差异（P＜0.01）。A1，A2，A3组MDA含量均明显降低，SOD活力提高。结果见图3。

2.3谱效学研究与药效物质筛选

运用双变量相关分析法建立谱效相关性数理统计模型：采用相关分析、多元回归分析、灰色关联度等数学方法，对川芎指纹图谱及药效学二者的相关性进行了考察，对指纹图谱与药效结果的内在联系进行研究［8］。

回归分析是研究1个或多个自变量与1个因变量之间是否存在某种线性或非线性关系的一种统计学方法［9］。双变量相关分析是研究变量之间密切程度的一种统计方法，将药物HPLC指纹图谱各峰的峰面积与其治疗心肌缺血的各项指标进行回归分析和相关性分析，利用SPSS 20.0统计软件线性回归分析、及双变量相关分析法处理。结果见表1和表2。

图3　川芎提取物对缺血-再灌注大鼠血清中SOD和MDA含量的影响（n=8）

表1　川芎各指纹峰的峰效双变量相关分析

表2　逐步回归法引入各色谱峰号

综合回归分析和双变量相关分析结果显示，1，2，3，4号峰均与治疗心肌缺血作用呈正相关，通过研究单个指纹峰面积与血清中各项指标的关联，发现均能不同程度地降低血清MDA含量的升高程度，提高SOD活力。对药效为增强作用，药效成分主要来自1，2，3，4号峰，对照指纹图谱中各对照品的保留时间提示其治疗有效成分别为川芎内酯A、藁苯内酯、川芎嗪和阿魏酸。

3　讨论

3.1色谱条件优选

在流动相的选择上，本试验先后应用乙腈-水和甲醇-水为流动相进行分离，试验后发现，用甲醇-水较乙腈-水体系时，有机相用量少，柱压低，色谱峰尖锐，分离效果好。因川芎药材化学成分较多，极性范围跨度较大，后经预试验筛选了不同比例不同梯度甲醇对各药效物质的分离效果，根据筛选，综合考虑各有效成分的分离情况、保留时间和基线漂移程度等因素，选定了适宜的甲醇、水梯度洗脱程序，加入适量冰醋酸调节pH，有效改善了色谱峰的拖尾现象。

采用二极管阵列检测器对检测波长在200～400 nm范围内进行了考察比较，发现当检测波长小于280 nm时基线有明显漂移，而波长大于325 nm时色谱峰数目开始减少，于322 nm波长处各色谱峰均有较强紫外吸收，分离度高，色谱信息多，故选322 nm检测波长。

3.2药效机制探讨

近年来，对心肌缺血损伤机制的深入研究发现，自由基的产生及脂质过氧化物反应增强与心肌缺血损伤的病理改变关系十分密切。心肌缺血时，自由基的生成增加，而自由基清除酶的活性降低，导致体内大量自由基堆积，进而使生物膜产生脂质过氧化反应，导致细胞膜的结构和功能损伤，从而加剧缺血心肌的组织损伤及功能障碍［10-11］。本试验结果显示，中药川芎的抗心肌再灌注损伤作用与其清除氧自由基、抑制脂质过氧化有关。

3.3谱效相关性分析

中药化学成分较复杂，研究和表征其药效物质基础难度大。本研究双变量相关分析、回归分析与药效试验结果基本一致，藁苯内酯、川芎内酯、阿魏酸和川芎嗪峰均与药理活性显著相关，其所代表的化合物能显著抑制冠状动脉结扎引起的心肌缺血，与部分文献［12］所述该类物质的药理作用一致，其中川芎嗪、阿魏酸可显著降低血清中丙二醛等指标的升高，是中药川芎治疗心肌缺血的主要有效成分；川芎提取物治疗心肌缺血是多种成分共同作用的结果。多元回归分析、双变量分析是研究多变量相关性的有效手段，通过色谱峰代表的化学成分信息与药效信息相关联，可有效发现成份复杂的中药的药效物质［13］。

中药指纹图谱分析是中药药效物质基础研究的来源，运用现代分析手段建立的药效物质数据库系统，为本研究奠定了研究基础。本研究中将指纹图谱技术运用于中药复杂成分的化学信息的采集，通过分析指纹图谱信息与药效活性的相关性，从中选取代表性成分作为药效物质基础，可系统表征该类中药复方整体成分-药效的相关性，为中药追踪分离药理活性成分，研发新药提供了借鉴。

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Spectrum-Effect Study on the Protective Efficacy of Ligusticum Chuanxiong Hort.on Myocardial Ischemia

Liu Xu，Cheng Yanqin，Cui Xiaobo，Li Mingchun
（Department of Pharmacy，PLA No.401 Hospital，Qingdao，Shandong，China266071）

ObjectiveTo investigate the protective efficacy of Ligusticum Chuanxiong Hort.on myocardial ischemia injury in rats and to study the spectrum activity relationship ofLigusticum Chuanxiong Hort.MethodsTheLigusticum Chuanxiong Hort.HPLC fingerprint analytical method was established，and the rat model of acute myocardial ischemia was established by applying left anterior descending coronary ligation.Bivariate correlation analysis and multivariate regression analysis were used to correlate the spectrum-activity relationship between fingerprints and anti-myocardial ischemia activity，and determine the spectrum activity relationship and efficacy material foundation of Ligusticum Chuanxiong Hort.ResultsLigustilide，Chuanxiong lactone，ferulic acid，both TMP was a significant positive correlation with efficacy，ferulic acid，TMP can significantly reduce elevated serum MDA，etc.，ferulic acid，and ligustrazine showed a significant positive correlation with efficacy，in which the ferulic acid，and ligustrazine could significantly reduce elevated serum MDA，and significantly increase the activity of SOD，and were the main active ingredients in Ligusticum Chuanxiong Hort.on myocardial ischemia injury.ConclusionBy Activity Relationship spectrum，the pharmacodynamic active substance is obtained，and the method of Chuanxiong spectrum activity relationship evaluation is established to objectively reflect the intrinsic quality of the drug，and provide references for the innovation study of such Chinese medicine.

Ligusticum Chuanxiong Hort.；fingerprint；spectrum-activity relationship；ferulic acid；ligustrazine

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2016）15-0009-04

国家自然科学基金面上项目，项目编号：30472178。

刘旭（1976-），女，硕士研究生，副主任药师，研究方向为药品质控，（电子信箱）xliu76@ 126.com；李明春（1965-），男，硕士研究生，主任药师，研究方向为药理学，本文通讯作者，（电子信箱）348036890@qq.com。

（2016-05-01）