贯叶金丝桃提取过程中黄酮类成分含量变化规律研究

唐小龙，罗旭，王小林，杨宋琪，陈海燕，柯潇

（四川济生堂药业有限公司，四川成都610041）

贯叶金丝桃提取过程中黄酮类成分含量变化规律研究

唐小龙，罗旭，王小林，杨宋琪，陈海燕，柯潇

（四川济生堂药业有限公司，四川成都610041）

目的研究贯叶金丝桃提取过程中黄酮类成分变化规律，建立其含量变化与提取时间的关系。方法色谱柱采用Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱，测定贯叶金丝桃提取过程中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的含量。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷在70%乙醇和水提取过程中稳定，15 min达到峰值，后趋于稳定。槲皮素在水提取过程中稳定，15 min达到峰值，后趋于稳定；在70%乙醇提取过程中，缓慢增加，6 h达到峰值。结论贯叶金丝桃在提取过程中黄酮类成分稳定，70%乙醇提取受热过程中，稳定性优于水提取。

贯叶金丝桃；提取；黄酮类成分；变化规律

贯叶金丝桃为藤黄科植物贯叶金丝桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分，原产于欧亚大陆，分布于我国湖北、四川、贵州、陕西、甘肃、湖南、新疆、山西、河南、江西、江苏、山东等地。贯叶金丝桃性平，味辛苦涩，具有疏肝解郁、清热利湿、消肿痛的功效。贯叶金丝桃醇提取物主要有萘并二蒽酮类、间苯三酚类、黄酮类、双黄酮类、苯丙烯酸类和花青素等成分，少量的单宁酸、氧杂蒽酮、挥发油和氨基酸等。黄酮类成分是贯叶金丝桃抗抑郁症的主要有效成分之一，具有较好的生理活性，对中、轻度抑郁症有效，且不良反应较传统的化学抗抑郁药物轻微，主要化合物为芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素等［1-16］。本研究中分析了贯叶金丝桃提取过程中黄酮类成分的变化规律，为临床应用提供参考。

1　仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（包括四元泵、紫外检测器、柱温箱、自动进样器、工作站）；Sartorius BP-211D型电子天平（德国赛多利斯）；美国Milli-Q型纯水器。

1.2试药

试验药材购于甘肃礼县，由成都康弘药业集团国家企业技术中心叶亮教授鉴定为藤黄科植物贯叶金丝桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分；芦丁对照品（批号100080-201409，供含量测定用，91.9%），金丝桃苷对照品（批号111521-201406，供含量测定用，92.5%），异槲皮苷对照品（批号111809-201403，供含量测定用，92.9%），槲皮素对照品（批号100081-201408，供含量测定用，99.1%），均购自中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；流动相：0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～25 min时84%～84%A，25～40 min时84%～35%A；流速：1 mL/min；检测波长：360 nm；进样量：5 μL。在此条件下，色谱图见图1。

2.2溶液制备

取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含芦丁76.30 μg、金丝桃苷57.86 μg、异槲皮苷60.12 μg、槲皮素71.59 μg的混合溶液，即得对照品溶液。

图1　高效液相色谱图

取贯叶金丝桃药材50 g，分别置1 L圆底烧瓶中，加70%乙醇或水0.5 L，加热回流提取，保持微沸状态，分别于0，0.25，0.5，1，2，4，6，8 h取样2 mL，立即冰水浴冷却，并分别补加2 mL 70%乙醇或水，以3 000 r/min离心10 min，上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3方法学考察

线性关系考察：精密量取含0.323 5 g/L芦丁、0.2322g/L金丝桃苷、0.3214g/L异槲皮苷、0.3439 g/L槲皮素混合对照品溶液0.5，1，2.5，5，10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀。分别吸取5 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的进样量（X，μg）为横坐标，以其峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归。结果见表1。

表1　黄酮类成分线性关系试验结果

精密度试验：取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素混合对照品溶液，按拟订色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的RSD分别为0.07%，0.11%，0.24%，0.12%（n=6），表明仪器精密度良好。

表2　黄酮类成分加样回收试验结果（n=6，%）

重复性试验：取贯叶金丝桃0.25 h 70%乙醇提取液6份，按供试品制备方法制备，按拟订色谱条件测定，记录峰面积。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的RSD分别为1.03%，0.50%，0.42%，1.17%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.2项下贯叶金丝桃0.25 h 70%乙醇提取液供试品溶液，室温放置0，2，4，8，12，24 h后，按拟订色谱条件测定，记录峰面积。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的RSD分别为0.38%，0.26%，0.30%，0.51%（n=6），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

加样回收试验：按2.2项下贯叶金丝桃供试品制备方法，取贯叶金丝桃0.25 h 70%乙醇提取液，共6份，冷却后分别加入一定量的混合对照品，依法测定，结果见表2。

2.4含量测定

按拟订色谱条件，分别测定贯叶金丝桃各提取液芦丁、金丝桃苷、异槲皮素、槲皮素的含量。结果见表3和图2。

表3　70%乙醇提取液和水提取液含量测定结果（%，n=2）

图2　贯叶金丝桃提取过程中变化规律

3　讨论

3.1提取成分选择

贯叶金丝桃提取主要有醇提和水提两种提取方式，主要考察了70%乙醇和水作为溶剂提取过程中黄酮类成分的变化规律。黄酮类成分主要有芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素等，故考察了4种黄酮类成分的变化规律。

3.2提取时间选择

贯叶金丝桃70%乙醇提取过程中，除槲皮素外，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷15 min内迅速升高，后趋于稳定。槲皮素缓慢增加，6 h趋于稳定。由图2可见，贯叶金丝桃黄酮类成分70%乙醇提取过程中溶出迅速，受热过程相对稳定。贯叶金丝桃水提取过程中，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素15 min内迅速升高，达到顶峰，后趋于稳定，2 h后略有降低。由图2可见，贯叶金丝桃黄酮类成分水提取过程中溶出迅速，受热过程中，稳定性比70%乙醇过程中较差。

3.3供试溶液处理

贯叶金丝桃70%乙醇和水提取离心和0.45 μm滤膜过滤后直接注入液相色谱仪测定，由图1可知，贯叶金丝桃提取液分离效果良好，可直接进样。

［5-13］，本试验经进一步优化，建立了HPLC法同时测定贯叶金丝桃中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素4种黄酮类成分含量的方法，方法简便、可行。

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Study on the Variation Patterns of Flavonoids inHypericum PerforatumL.at Different Decocting Time

Tang Xiaolong，Luo Xu，Wang Xiaolin，Yang Songqi，Chen Haiyan，Ke Xiao
（Sichuan Jishengtang Pharmaceutical Co.Ltd.，Chengdu，Sichuan，China610041）

ObjectiveTo study on the variation patterns of the flavonoids in Hypericum Perforatum L.at different decocting time and to establish the relationship between the content and extraction time.MethodsThe Agilent C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）was used，0.1%phosphoric acid（A）and acetonitrile（B）as mobile phase，gradient elution，to determine the extract content o rutin，hyperoside，isoquercitrin，quercetinHypericum Perforatum L.ResultsRutin，hyperoside and isoquercitrin in 70%ethanol and water extraction process of stability，reached a peak of 15 min and then tended to be stable；quercetin in water extraction process of stable for 15 min，reached a peak and then tended to be stable.In the 70%ethanol extraction process，slowly increased，peaked at 6h.ConclusionHypericum perforatum L.in the extraction process of flavonoids in stable，70%ethanol extraction in the process of heating，the stability is better than water extraction.

Hypericum perforatum L.；extraction；flavonoids；variation patterns

R284.2；R282.71

A

1006-4931（2016）15-0013-04

四川省重大产业技术创新专项，项目编号：2012CD00082；四川科技成果转化项目，项目编号：2012SC0029。

唐小龙（1987-），男，硕士研究生，工程师，研究方向中药质量标准研究，（电话）028-64287669（电子信箱）594195569@qq.com；柯潇（1983-），男，大学本科，高级工程师，研究方向为中药新药研究，本文通讯作者，（电话）028-64287669。

（2016-02-18；

2016-04-30）