蛹虫草菌丝体酶解制备多肽的工艺研究

朱振元，孟洁，樊梅香，王明飞，王铮，苗信凯

（食品营养与安全教育部重点实验室/天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

蛹虫草菌丝体酶解制备多肽的工艺研究

朱振元，孟洁，樊梅香，王明飞，王铮，苗信凯

（食品营养与安全教育部重点实验室/天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

蛹虫草和冬虫夏草是药食兼用的真菌，具有对人体有益的多种活性作用。以液体发酵后干燥的蛹虫草菌丝体粉末为原料，分别以底物浓度、温度、pH、加酶量和时间为条件，分析单因素对菌丝体酶解效果，结果表明：当蛹虫草菌丝体酶解液多肽指数达最大时，各个条件分别为：底物浓度10%左右；温度42℃左右；pH为2.0；加酶量2.5%；时间8 h。然后通过正交试验优化菌丝体多肽，获得最佳酶解工艺，即反应温度为42℃、时间为8h、底物浓度为10%、加酶量为2.5%。最后利用Tricine-SDS-PAGE电泳确定多肽的分子量范围，结果表明：蛋白酶酶解蛹虫草菌丝体酶解液多肽主要分布在3160Da～7629Da附近。

蛹虫草菌丝体；多肽；酶解；电泳

蛹虫草又别名北冬虫夏草，我国各省区均有遍布，春至秋天在半埋于林地上或腐枝落叶层下的鳞翅目昆虫蛹上长出。隶属于真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、球壳目、麦角菌科、虫草属，与冬虫夏草同属异种。研究表明二者具有极相似的有效成分和作用［1］。

生物活性肽因为高吸收率、低毒、零污染等特点，在医药、食品、畜牧养殖等领域都有广泛应用。Byung TP等从蛹虫草子座中分离得到分子量为12 kDa的小分子蛋白肽［2］，经检测其对尖孢镰刀菌有显著抗菌活性，并能对人乳腺癌和膀胱癌细胞有抑制作用。目前有关蛹虫草的核苷类、多糖类物质的研究报道较多，但对于其蛋白质多肽方面的研究较少。Ng TB等从蛹虫草中提取到天然活性肽Cordymin［3］，测定到此多肽分子量为10.90 kDa，其对玉米小班病菌、球腔菌、丝核菌、加拿大白色念珠菌都有显著抑制作用，但蛹虫草中多肽含量微少。通过对蛹虫草酶解制备多肽，可以更好的挖掘蛹虫草的药用价值。

采用实验室提供的蛹虫草菌丝体，通过单因素试验，从控制底物浓度、加酶量、溶液pH、反应温度、反应时间5个因素来确定最佳酶解条件。选用胰蛋白酶和胃蛋白酶分别进行水解，以可溶性氮含量为指标，用正交试验优化了最佳酶解工艺。最后采用Tricine-SDS-PAGE电泳法对蛹虫草菌丝体多肽初步鉴定，分析蛹虫草菌丝体多肽分子量分布。

1　材料与方法

1.1原料与试剂

蛹虫草菌丝体：由天津科技大学生物资源与功能食品研究室保存的蛹虫草菌种经液体发酵、干燥而得。

胰蛋白酶（10 000 U/g）、胃蛋白酶（3 500 U/g）：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2主要仪器设备

SP2102UV型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；ESJ205-4电子天平：沈阳龙腾电子标量仪器有限公司；a/CYAB30立式压力蒸汽灭菌锅：上海华线医用核子有限公司；DFG801型电热鼓风箱：湖北省黄石市医疗器械厂；G10型医用高速离心机：安新县白洋离心机厂；MODEL808酸度计：美国奥利龙；LGJ-0.5台式冷冻干燥机：军事医学科学院实验仪器厂；冷藏冰箱BCD-215F/T：青岛澳柯玛有限公司。

1.3方法

1.3.1蛹虫草菌丝体蛋白含量的测定

采用凯氏定氮法测定蛋白质含量。

1.3.2蛹虫草菌丝体酶解液的制备

1.3.2.1酶解工艺

准确称取菌丝体干粉末，加入蒸馏水，然后用1 mol/L氢氧化钠或1 mol/L氯化钠用酸度计调节所需的pH，加入相应的蛋白酶，进行水解。在水解过程中要一直保持pH得恒定，待水解结束，将样品溶液煮沸，促使酶失去活性。放置冷却后，以8 000 r/min的转速离心，取上清液，再用蒸馏水洗1次沉淀离心后合并，记录体积。然后用三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI）法测可溶性氮浓度［4］。

1.3.2.2酶解度测定

TCA-SN%法：取3 mL水解液与3 mL 10%TCA溶液混合后反应30 min，在4 200 r/min下离心20 min，量取上清液1.0 mL于试管中，加入4.0 mL双缩脲试剂，室温放置30 min，反应结束后，用紫外可见分光光度计在波长540 nm下测定吸光度值，然后按照如下公式算出蛹虫草菌丝体的多肽指数［5］。

式中：TCA-SN%为蛹虫草酶解液多肽指数；C为蛋白质浓度，mg/mL；V为上清液体积，mL；W为蛹虫草菌丝体的质量，mg。

1.3.2.3制作标准曲线

取6支干净试管进行编号，按照表1加入试剂，充分混匀，在室温下放置30 min反应，然后用紫外可见分光光度计在波长540 nm下测定吸光度值。以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制蛋白质浓度标准曲线。

表1　标准曲线的制作Table 1Production of standard curve

1.3.2.4样品的蛋白质浓度测定

量取水解液与TCA混合上清液1.0 mL于试管中，加入4.0 mL双缩脲试剂，室温放置30 mim，反应结束后，用紫外可见分光光度计在波长540 nm下测定吸光度值，根据标准曲线方程，计算样品中蛋白质的浓度，可得可溶性氮含量。

1.3.2.5蛋白酶的选择

经研究发现，胰蛋白酶和胃蛋白酶处理效果较好，故本试验选择胰蛋白酶和胃蛋白酶进行试验。

1.3.3单因素试验设计

1.3.3.1底物浓度对蛹虫草菌丝体酶解效果的影响

称取菌丝体粉末1.0 g放入锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物浓度分别为6%、8%、10%、12%、14%，调节溶液的pH为2.0，加入2.5%的胃蛋白酶，37℃酶解8 h，沸水浴10 min，抽滤，用TCA-NSI法和双缩脲法测定滤液的蛋白质浓度，按照上述公式算出滤液中多肽指数［6］。重复3次，取平均值。

1.3.3.2反应温度对蛹虫草菌丝体酶解效果的影响

称取菌丝体粉末1.0 g，加入蒸馏水调节底物浓度为10%，调节溶液的pH初始为2.0，加入2.5%的胃蛋白酶，分别在温度25、30、37、42、50℃下酶解8 h，沸水浴10 min，抽滤，用TCA-NSI法和双缩脲法测定滤液的蛋白浓度，按照公式算出滤液中的多肽指数。重复3次，取平均值。

1.3.3.3初始pH值对蛹虫草菌丝体酶解效果的影响

称取蛹虫草菌丝体粉末1.0 g，加入蒸馏水调节底物浓度为10%，调节溶液的pH分别为1.0、1.5、2.0、3.0、4.0，加入2.5%的胃蛋白酶，37℃酶解8 h，沸水浴10 min，抽滤，用TCA-NSI法和双缩脲法测定滤液的蛋白浓度，按照公式算出滤液中的多肽指数。重复3次，取平均值。

1.3.3.4加酶量（胃蛋白酶）对蛹虫草菌丝体酶解效果的影响

称取菌丝体粉末1.0 g，加入蒸馏水调节底物浓度为10%，调节溶液的pH为2.0，分别加入1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的胃蛋白酶，37℃酶解8 h，沸水浴10 min，抽滤，用TCA-NSI法和双缩脲法测定滤液的蛋白浓度，按照公式算出滤液中的多肽指数。重复3次，取平均值。

1.3.3.5反应时间对蛹虫草菌丝体酶解效果的影响

称取蛹虫草菌丝体粉末1.0 g，加入蒸馏水调节底物浓度为10%，调节溶液的pH为2.0，加入2.5%的胃蛋白酶，37℃分别酶解2、4、6、8、10h，沸水浴10min，抽滤，用TCA-NSI法和双缩脲法测定滤液的蛋白浓度，按照公式算出滤液中的多肽指数。重复3次，取平均值。

1.3.4正交试验设计

1.3.4.1分别选择胰蛋白酶和胃蛋白酶进行正交试验

由于胰蛋白酶和胃蛋白酶在各自最适的温度和pH范围内对酶促反应的影响不大，所以本试验选取其他因素：底物浓度、加酶量和时间3个因素，优化了最优蛋白酶的工艺条件进行正交试验［7］。

采用三因素三水平进行正交试验，如表2所示。

表2　正交试验因素水平Table 2The orthogonal experiment factor levels

1.3.4.2胰蛋白酶和胃蛋白酶以1∶1的比例进行正交试验

采用四因素四水平进行正交试验，如表3所示。

表3　正交试验因素水平Table 3The orthogonal experiment factor levels

1.3.4蛹虫草菌丝体活性肽的分离纯化

1.3.4.1蛹虫草菌丝体酶解液的脱色

蛹虫草菌丝体粗品利用大孔吸附树脂AB-8进行脱色，先将AB-8超声脱气0.5 h，将多余的蒸馏水倒出，使用玻璃棒边搅拌边将AB-8缓慢地灌入层析柱中（柱尺寸2.5 cm×20 cm），轻轻敲击柱壁，使填料沉降均匀、紧密，用蒸馏水平衡2 h，使层析柱达到平衡状态，填料紧密结实，备用［8］。然后将酶解液用胶头滴管加入层析柱中。用蒸馏水洗脱，并收集洗脱液，备用。

1.3.4.2蛹虫草菌丝体酶解液的浓缩

将经过脱色后的蛹虫草菌丝体酶解液用旋转蒸发仪进行初次浓缩，等到体积小于原体积的1/2时，放入冷冻干燥机中进行冷冻再次浓缩，备用。

1.3.4.3Tricine-SDS-PAGE电泳

分别量取2 mL经过浓缩干燥处理的蛹虫草菌丝体酶解液和蛋白Marker，加入2 mL样品缓冲液，在涡旋混匀器上混合均匀，沸水浴15 min，冷却后准备点样。每次点样量40 μL。

2　结果与讨论

2.1蛹虫草菌丝体蛋白含量的测定结果

2.1.1蛋白含量测定结果

经过凯氏定氮法滴定分析后，得到蛹虫草菌丝体的蛋白质含量为26.782 g/kg。

2.1.2标准曲线的的制作

图1是以标准蛋白浓度为横坐标、以吸光度值为纵坐标绘作的标准曲线，得到蛋白质浓度与吸光度之间的回归方程为：y=0.045 3x+0.000 9（R2=0.999 7）。

图1　牛血清蛋白的标准曲线图Fig.1Standard curve of bovine serum protein

2.2对蛹虫草菌丝体酶解效果影响因素结果

底物浓度、反应温度、初始pH、加酶量、反应时间分别对多肽指数的影响见图2～图6。

图2　底物浓度对多肽指数的影响Fig.2Effect of substrate concentration on the peptide index

图3　反应温度对多肽指数的影响Fig.3Effect of reaction temperature on the peptide Index

图4　初始pH对多肽指数的影响Fig.4Effect of initial pH on thepeptide index

图5　加酶量对多肽指数的影响Fig.5Effect of the amount of enzyme on the peptide index

图6　反应时间对多肽指数的影响Fig.6Effect of reaction time on the peptides index

如图2所示，随着酶解液底物浓度的逐渐增大，多肽指数呈现先增大后减小的趋势线，在底物浓度10%左右时，多肽指数最大；如图3所示，随着反应温度的逐渐增大，多肽指数呈现先增大后减小的趋势线，当反应温度42℃左右时，多肽指数最大；如图4所示，随着初始pH的逐渐增大，多肽指数呈现先增大后减小的趋势线，在pH2时，多肽指数最大；如图5所示，随着加酶量的逐渐增大，多肽指数呈现先增大后减小的趋势线，在加酶量2.5%时，多肽指数最大；如图6所示，随着反应时间的逐渐增长，多肽指数呈现先增大后减小的趋势线。在反应时间8 h时，多肽指数最大。

2.3正交试验结果

2.3.1胰蛋白酶水解正交试验结果

胰蛋白酶水解正交试验分析结果见表4和表5。

表4　胰蛋白酶水解直观分析结果表Table 4Analysis of the results of Trypsin Hydrolysis

表5　胰蛋白酶水解方差分析表Table 5Analysis of variance of trypsin hydrolysis

由表4可以看出，影响胰蛋白酶水解的各因素的顺序为时间（A）＞加酶量（B）＞底物浓度（C），由表5方差分析可以看出，其中P（A）＞0.05，所以反应时间对胰蛋白酶水解试验有显著的影响，由直观分析和方差分析得出，以胰蛋白酶为水解酶，得到的最佳酶解组合为A2B2C2，即反应时间为4 h、底物浓度为10%、加酶量为2.5%时用胰蛋白酶水解效率最高。

2.3.2胃蛋白酶水解正交试验结果

胃蛋白酶水解正交试验分析结果见表6和表7。

由表6和表7可以看出，影响胃蛋白酶水解的各因素的顺序为时间（A）＞加酶量（B）＞底物浓度（C），所以由直观分析和方差分析得出，以胃蛋白酶为水解酶，得到的最佳酶解组合为A3B2C2，即反应时间为6 h、底物浓度为10%、加酶量为2.5%时用胰蛋白酶水解效率最高。

表6　胃蛋白酶水解直观分析结果Table 6The results of the visual analysis of pepsin hydrolysis

表7　胃蛋白酶水解方差分析表Table 7Analysis of variance of pepsin hydrolysis

2.3.3胰蛋白酶和胃蛋白酶以1∶1的比例进行水解的正交试验结果

以胃蛋白酶和胰蛋白酶为水解酶，水解正交试验分析结果见表8和表9。

表8　复合酶水解直观分析结果Table 8Analysis of the results of compound enzymatic hydrolysi

续表8　复合酶水解直观分析结果Continue table 8Analysis of the results of compound enzymatic hydrolysi

表9　复合酶水解方差分析表Table 9Analysis of variance of compound enzyme hydrolysis

由表8和表9可以看出，双酶得到的最佳酶解组合为A3B4C3D3，即反应温度为42℃、时间为8 h、底物浓度为10%、加酶量为2.5%时用双酶水解效率最高，4个因素对水解影响的程度分别为温度＞时间＞加酶量＞底物浓度。

2.4蛹虫草菌丝体活性肽的分离纯化结果

2.4.1Tricine-SDS-PAGE电泳

根据Tricine-SDS-PAGE电泳中标准蛋白Marker的分子量大小和迁移距离，以Marker的分子量对数为纵坐标，以Marker迁移距离为横坐标做回归标准曲线。如图7所示；得到marker分子量对数（y）和迁移距离（x）间的回归方程为：y=-0.216 9x+4.779 4（R2= 0.936 9）。

如图7所示，此图是蛹虫草菌丝体酶解液经过Tricine-SDS-PAGE电泳后的条带分布图，条带比较模糊，但是能看清楚大概位置，根据标准蛋白Marker测量其迁移距离，然后使用回归方程y=-0.216 9x+ 4.779 4计算蛹虫草菌丝体酶解液电泳后各片段分子量大小，结果表明蛹虫草菌丝体酶解液电泳后条带主要集中分布在16 423 Da、3 160 Da～7 629 Da。结合生物活性肽的分子量分布范围，多肽是分子是小分子物质。可知蛋白酶酶解蛹虫草菌丝体酶解液多肽主要分布在3 160 Da～7 629 Da。

图8　蛹虫草菌丝体酶解液电泳结果Fig.8Cordycepsmilitaris mycelium enzymolysis liquid electrophoresis results

3　结论

本试验通过凯氏定氮法测定蛹虫草菌丝体蛋白含量为26.782 g/kg，酶解的最佳优化工艺为A3B4C3D3，即反应温度为42℃、时间为8 h、底物浓度为10%、加酶量为2.5%；制备蛹虫草多肽的最佳工艺条件为：反应时间8 h、加酶量2.5%、底物质量浓度10%、反应温度42℃、初始pH为2，此条件可以达到最大程度的多肽指数。Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明，蛹虫草菌丝体多肽主要集中分布在3 160 Da～7 629 Da附近。

［1］张显科，刘文霞.不同培养料栽培蛹虫草实验研究［J］.中国食用菌，1997，16（2）：21-22

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［3］陈俐彤，曹红峰，黄文芳.蛹虫草的化学成分、药效及应用［J］.现代食品科技，2005（3）：192-194，197

［4］张亚楠，蔡晓琴，彭海东.酶法水解制备蛹虫草子实体活性多肽的研究［J］.亚太传统医药，2012，8（8）：25

［5］李红敏，周小理.荞麦多肽的制备及其抗氧化活性的研究［J］.食品科学，2006，6（18）：301-306

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［8］罗晓妙，史碧波，易莹敏.鸡枞菌酶解工艺研究［J］.食品研究与开发，2008，28（2）：89-92

Study on Preparation Process of Peptides from Cordyceps Mycelium by Enzymolysis

ZHU Zhen-yuan，MENG Jie，FAN Mei-xiang，WANG Ming-fei，WANG Zheng，MIAO Xin-kai
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education/College of Food Science and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Cordyceps Militaris belongs to the group of Cordyceps sinensis is a kind of edible fungus with similar drug effects.It has a variety of beneficial effects to human，such as regulating immunity，tumor inhibition and anti-aging activity.In this paper，substrate concentration，temperature，pH，enzyme dosage and time were set as control conditions，respectively to univariate analysis the digestion effect on mycelial.The result was shown that the condition for hydrolyzate peptides index mycelia reaching maximum wasthe substrate concentration of about 10%，the temperature around 42℃，the initial pH at 2.0，the enzyme dosage at 2.5%and the time at 8 h. Then the conditions were optimized by orthogonal experiments of mycelium polypeptides.The result indicated that the best condition for the enzymatic hydrolysis process were as follows：reaction temperature was 42℃，time was 8 h，substrate concentration of 10%，enzyme dosage of 2.5%.Finally the molecular weight of the polypeptide was identified by the tricine-SDS-PAGE electrophoresis method.Theresults showed that the weight of peptides by protease mycelialhydrolyzatedare varied from 3 160 Da to 7 629 Da.

Cordyceps militaris mycelium；peptide；enzymolysis；electrophoresis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.023

国家农业科技成果转化资金项目（2011GB2A100009）；天津市高等学校科技发展基金计划项目（20090604）；天津科技大学科学研究基金资助项目（20120106）

朱振元（1969—），男（汉），教授，博士，研究方向：生物资源与功能食品。

2015-12-04