畜禽舍空气细菌内毒素两种检测方法的比较研究

钟召兵，王 宁，杨夫会

（泰安市岱岳区畜牧兽医局，山东泰安　271000）



畜禽舍空气细菌内毒素两种检测方法的比较研究

钟召兵，王 宁，杨夫会

（泰安市岱岳区畜牧兽医局，山东泰安271000）

［目的］比较气相色谱-串联质谱法（GC-MSMS）与鲎试验（LAL）在检测畜禽舍空气内毒素中的应用效果及相关性，以及气载内毒素是否对环境和饲养人员健康构成危害。［方法］通过国际标准AGI-30液体冲击式空气采样器，在4个养殖场16个畜禽舍采集空气样品，采用GC-MSMS与LAL测定空气细菌内毒素浓度。［结果］LAL测定的牛舍、猪舍、羊舍和禽舍空气细菌内毒素浓度中间值分别为1.85×105EU/m3、2.76×106EU/ m3、4.82×105EU/m3、6.55×106EU/m3；而GC-MSMS测定的分别为3.3×104EU/m3、1.26×105EU/m3、2.4×104EU/m3和8.21×105EU/m3。GC-MSMS在禽舍检测出的空气内毒素浓度显著大于其他畜舍（p＜0.05）。用LAL和GC-MSMS分析测定的空气中内毒素浓度超过了对大多数动物和人体有威胁的阈限值1.0×103EU/m3。用GCMSMS与LAL测定的禽舍和羊舍空气样品中细菌内毒素浓度之间存在显著相关（p＜0.05），而牛舍和猪舍之间浓度没有显著相关性。GC-MSMS主要检测存在于动物舍空气内毒素中含有C14-C18链的3-羟基脂肪酸。LAL测定的内毒素浓度与含有C14-C16链3-羟基脂肪酸量之间有显著相关（p＜0.05）。［结论］ GC-MSMS与LAL联合应用可以提高检测气载内毒素的准确性，且本研究表明畜禽舍中检测到的空气细菌内毒素浓度可以危害人类和家畜动物健康。

畜禽舍；气载细菌内毒素；鲎 试验；气相色谱-质谱；3-羟基脂肪酸

动物养殖场空气中含有大量微生物，包括真菌、病毒、尘螨、孢子、细菌及产物。其中细菌内毒素可对动物及人体产生极大的危害，可引起人体发热甚至休克。气载内毒素已经被确定为导致人类和动物呼吸道疾病的重要因素［1］。内毒素可引起组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等的释放，导致急性炎症，破坏在肺部进行气体交换自由基的释放，在肺部引起炎症反应及严重的支气管痉挛。

内毒素通常用鲎试验（LAL）检测。当极微量内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。这种技术被认为是检测细菌内毒素生物活性的有效方法，但具有非特异性。细菌内毒素的毒性及生物活性中心类脂A的长链脂肪酸部分经水解形成相应的3-羟基脂肪酸，经衍生化后可通过气相色谱-串联质谱法（GS-MSMS）进行检测，与LAL试验相比，其细菌内毒素的浓度结果更精确，且不受非特异影响。

目前，空气中内毒素含量在多少之内不会影响动物和人类健康等问题还在研究中。Donham等［2］研究提出，环境中气载内毒素对人体产生威胁的浓度是1.5×104EU/m3。而据大量的研究，环境中气载内毒素的浓度对人体和动物无影响的推荐标准为1.0×103EU/m3。

本研究采用LAL和GC-MSMS对畜禽养殖场环境空气中气载细菌内毒素的浓度进行检测和分析，比较两种方法之间的相关性以及效用，了解动物养殖舍气载细菌内毒素的现状及对饲养人员和畜禽潜在的健康威胁，为有效控制畜禽疾病的流行提供科学依据和预警资料。

1　材料与方法

1.1动物养殖舍情况

本试验在4个畜禽养殖场16个畜禽舍内进行，各个养殖场的具体情况见表1。

表1　被研究的畜禽养殖场情况

1.2环境空气细菌内毒素样品采集

利用国际标准AGI-30液体冲击式空气采样器采集样品（All Glass Impinger AGI-30），通过鲎变形细胞溶解物试验（Limulus Amebocyte Lysate Test）检测。将收集器置于舍中央，放置高度为80 cm，以50 mL内毒素检查用水（湛江海洋生物制品厂）为采样介质，采样时气流速度为12.5 L/min，驱动时间为30 min。在每一个采样点收集两个样本，一个用于LAL试验，另一个用于GC-MSMS分析。所有样本存储在-15 ℃。

1.3LAL试验

提取样品液100 mL，在室温条件下离心1 h，并加热到100 ℃ 15 min （溶解内毒素和干扰物质失活），冷却后，按照《中国药典2010版》附录XIE细菌内毒素检查法测定样品中气载内毒素浓度［3］。

1.4GC-MSMS试验

将100 mL样品液经过2次正己烷萃取后，在洗脱液中加入1.0 g在400 ℃马弗炉内4 h后冷却的无水硫酸钠，除去水分，转移试管后用微弱氮气缓慢吹干，加入0.4 mL丙酮及0.05 mL BSTFA衍生化试剂，剧烈震荡0.5 min，室温下衍生化30 min，使反应完全。最后加入0.01 mL内标液，定容至0.5 mL，备GC-MSMS定量分析。

色谱条件：色谱柱为DB-5（60 m×0.25 mm i.d.）；载气为氦气，恒压，柱前压206 kPa；进样口温度为250 ℃；柱温：初始温度为90 ℃，在此温度下保持5 min，然后以5℃ /min的升温速率升至280 ℃，在此温度下保持5 min，进样量为1 μL，不分流进样。

质谱条件：电子轰击离子源（EI）；离子源温度为250 ℃；接口温度为280 ℃；质谱扫描范围：m/z 13～449。溶剂延迟时间为10 min.

1.5统计分析

因为空气中微生物数据呈非正态分布，为了减少数据误差，达到比较准确反应真值的目的，将畜禽舍环境气载内毒素浓度采用中间值（Median）表示［4］。此外，用Mann-Whitney检验确定特定环境之间的差异，使用Windows 5.0package（StatSoft STATISTIC，美国）对两种方法进行相关性分析。

2　结果

2.1鲎试验测定的环境气载内毒素浓度

鸡舍内毒素浓度最大，为5.2×104～1.06×107EU/m3（中 间 值：6.55×106EU/m3）； 羊 舍 为2.62×105～2.144×106EU/m3（中间值：4.82×105EU/m3）；猪舍为1.9×104～1.32×107EU/m3（中间值：2.76×106EU/m3）；牛舍内毒素浓度的中位数最小，为1.73×104～3.83×105EU/m3（中间值：1.85×105EU/m3）（表2）。

鲎试验的结果表明，其随机分布特征变化较大，但是封闭式禽舍与牛羊舍的内毒素浓度之间有显著差异（P＜0.05）。

2.2气相色谱-质谱联用仪测定的气载内毒素浓度

空气中内毒素浓度最大是鸡场，为2.83×105～1.10×106EU/m3（ 中 间 值：8.21×105EU/m3）。此浓度与牛场、猪场和羊场的浓度有显著差异（P ＜0.05）（表2）。牛场气载毒素的浓度为3.8×103～1.41×105EU/m3（中间值：3.3×104EU/m3），猪场为2.3×104～2.37×105EU/m3（中间值：1.26×105EU/m3）。气载内毒素浓度最小的为羊场，为6.7×103～2.87×104EU/m3（中间值：2.4×104EU/m3）（表2）。

2.3GC-MSMS采用3-羟基脂肪酸（C10-C18）特异性测定的内毒素浓度

革兰氏阴性细菌内毒素所含的长链脂肪酸经水解形成相应的3-羟基脂肪酸，利用其共同特征10-18碳链对3-羟基脂肪酸进行分析，这为GCMSMS提供了检测革兰氏阴性细菌内毒素的基础。总之，在畜禽场空气中细菌内毒素类脂A的长链脂肪酸水解产生14-18碳链是其共同特征。在羊场和鸡场，3-OH-C16和3-OH-C18占大部分；而在猪场、牛场，3-OH-C14和3-OH-C16占优势。而短碳链（10-12C）脂肪酸极少，在此环境下不会被检测到（表2）。

2.4LAL与GC-MSMS的结果对比

在禽场和羊场的空气样本中，LAL试验测定的具有生物活性的内毒素浓度与GC-MSMS测定的细菌内毒素浓度之间存在显著相关性（相关系数分别为R =1.0且r = 0.95，P ＜0.05），在牛场和猪场采集的空气样品中，具有生物活性的内毒素浓度与GC-MSMS测定细菌内毒素浓度之间无显著相关。在所有空气样品中，LAL试验测定的生物活性内毒素浓度与GC-MSMS测定的3-羟基脂肪酸总量与3-OH-C14、3-OH-C16和3-OH-C16-18之间存在显著相关性（P ＜0.05）（表3）。

对采集的所有空气样本，LAL试验测定的生物学活性内毒素总浓度和3-OH-C14、3-OH-C16、3-OH-C16-18的纳摩尔总和与GC-MSMS测定的3-羟基脂肪酸总和之间没有显著相关性（P ＜0.05）（表3）。LAL测定的空气细菌内毒素总浓度与GC-MSMS测定的空气中内毒素总浓度之间的没有显著相关性（P＞0.2）。

3　讨论

在四种畜禽场中，养殖场工人和舍内动物吸入气载细菌内毒素产生潜在的健康风险最大。LAL法和GC-MSMS法测定的畜禽舍空气中内毒素浓度超过了对人和大多数动物无影响的推荐标准1.0×103EU/m3。在16个样品中11个通过LAL（68.8%）和16个样品中10个通过GC-MSMS（62.5%）测定的气载毒素在1.0×105～1.02×105EU/m3之间，有对工人和动物造成呼吸系统疾病的潜在威胁。

本次研究的气载内毒素浓度比此前研究报道的要高，应是所采用的方法和检测环境条件存在差异导致的。由LAL或GC-MSMS法测定的牛舍气载内毒素浓度比来自德国Berger等［5］报道的1.55×106EU/m3要小，比波兰Dutkiewicz等［6］报道的1.0×104EU/m3要高。在养猪场，由LAL测定的空气中内毒素浓度比韩国Chang等［7］和美国Donham等［8］分别报道的2.98×102EU/m3、8×105EU/m3要高，类似于加拿大Zejda等［9］报道的1.35×106EU/m3，但比波兰Mackiewicz等［10］报道的12.46×106EU/m3要小。在养猪场通过GC-MSMS测定的空气内毒素浓度比来自韩国Chang 等［7］报道的3.68×101EU/m3要高，比英国Simpson 等［11］报道的7.2×105EU/m3要小。在禽舍由LAL测定的空气中内毒素浓度比美国Donham等［8］报道的6.14×102EU/m3要高。在禽舍用GC-MSMS测定的空气中毒素浓度比美国Donham等［8］报道的1.0×102EU/m3要高，比英国Simpson 等［11］报道的1.03×106EU/m3要小。

表2　LAL和GC-MSMS检测畜禽养殖场空气内毒素浓度

表3　GC-MSMS检测内毒素和LAL检测具有生物活性内毒素与3-羟基脂肪酸浓度之间的相关性

关于羊场气载内毒素，至今很少有研究报道。本研究表明绵羊舍空气中内毒素浓度非常高，通过LAL法检测的气载内毒素浓度超过了对人和大多数动物无影响推荐标准，对饲养人员存在引起呼吸道疾病的潜在威胁。

LAL与GC-MSMS方法在羊棚和禽舍测定的气载内毒素浓度存在显著相关性，其他动物舍的浓度之间没有相关性。在本研究中LAL测定的内毒素浓度通常高于GC-MSMS法。这不符合早期报道的研究结果，可能是由于影响两种方法非特异性的LAL反应的存在。在本研究中，GC-MSMS法比LAL法测定的结果更精确，因此GC-MSMS法可以作为内毒素测定的可靠方法。

用GC-MSMS法可检测舍空气内毒素中含有14-18碳链（3-OH-C14-18）的3-羟基脂肪酸。3-OH-C14是肠杆菌科革兰氏阴性菌产生内毒素的特征之一。应注意的是，在本研究中，LAL试验测定得生物学活性内毒素的浓度与GC-MSMS分析测定的3-OH-C14和3-OH-C16总量之间存在显著相关性。这表明含有14-16碳链3-羟基脂肪酸特征的内毒素会对舍内畜禽和饲养工人产生危害。而3-OH-C18没有特异性，因为在一些革兰氏阳性菌如放线菌中也可检测到。

［1］ Schierl R，Heise A，Egger U，et al. Endotoxin concentrations in modern animal houses in southern Bavaria［J］. Ann Agric Environ Med，2007，14：129-136.

［2］ Donham K J，Haglind P，Peterson Y，et al. Environmental and health studies of farm workers in Swedish swine confi nement buildings［J］. Brit J Ind Med，1989，46：31-37.

［3］ 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典：二部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录99-102.

［4］ 金丕焕.医学统计方法［M］ .上海：上海医科大学出版社，1992：20-21.

［5］ Berger I，Schierl R，Ochmann U，et al. Concentrations of dust，allergens and endotoxin in stables，living rooms and mattresses from cattle farmers in southern Bavaria［J］. Ann Agric Envi- ron Med，2005，12：101-107.

［6］ Dutkiewicz J，Pomorski Z J H，Sitkowska J，et al. Airborne microorgan- isms and endotoxin in animal houses［J］. Grana，1994，33：85-90.

［7］ Chang C W，Chung H，Huang CF，et al. Exposure assessment to airborne endotoxin，dust，ammonia，hydrogen sulfide and carbon dioxide in open style swine houses［J］. Ann Occup Hyg，2001，45：457-465.

［8］ Donham K J，Cumro D，Reynolds S J，et al. Doseresponse relationships between occupational aerosols exposures and cross-shift de-clines of lung function in poultry workers. Recommendations for expo- sure limits［J］. J Occup Med，2000，42：260-269.

［9］ Zejda J E，Barber E，Dosman J A，et al. Respiratory health status in swine producers relates to endotoxin exposure in the presence of low dust levels［J］. J Occup Environ Med，1994，36：49-56.

［10］ Mackiewicz B. Study on exposure of pig farm workers to bioaero- sols，immunologic reactivity and health effects［J］. Ann Agric Environ Med，1998，5：169-175.

［11］ Simpson J C，Niven R M，Pickering C A，et al. Comparative personal exposures to organic dusts and endotoxin［J］. Ann Occup Hyg，1999，43：107-115.

（责任编辑：杜宪）

Comparison of Two Detection Methods for Airborne Bacterial Endotoxin in Livestock and Poultry Houses

Zhong Zhaobing，Wang Ning，Yang Fuhui
（Daiyue Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Taian，Shandong 271018）

［Objective］ To compare the application effect and correlation of the gas chromatography-tandem mass spectrometry method（GC-MSMS）and the Limulus test（LAL）in testing the airborne endotoxin，and to analyze whether airborne endotoxin is harmful to the environment and breeders health. ［Methods］ Air samples were collected by using the international standard AGI-30 air samplers of liquid impingement in 16 livestock and poultry houses from 4 farms，and examined for the concentration of bacterial endotoxin with the LAL test and GC-MSMS technique. ［Results］The median concentrations of airborne endotoxin determined by LAL test in cow barns，piggeries，sheep sheds and poultry houses were 1.85×105EU/m3，2.76×106EU/m3，4.82×105EU/m3，6.55×106EU/m3respectively，while those measured by the GC-MSMS technique were respectively 3.3×104EU/m3，1.26×105EU/m3，2.4×104EU/m3and 8.21×105EU/m3. The concentrations of airborne endotoxin detected by GC-MSMS method in poultry houses were signifi cantly higher than any other examined barns（p＜0.05）. The concentrations of airborne endotoxin determined with LAL test and GC-MSMS analysis surpassed the threshold（1.0×103EU/m3）above which would be harmful to most animals and humans. A signifi cant correlation（p＜0.05）between the concentrations of endotoxin determined bythe LAL and GC-MSMS techniques was found in the air samples from poultry houses and sheep sheds，but not found in other examined barns. GC-MSMS method was designed to detected 3-hydroxy fatty acids containing C14-C18chains of airborne bacterial endotoxin in livestock and poultry houses. A signifi cant correlation（p＜0.05）was found between the concentrations of endotoxin determined with LAL test and the amounts of 3-hydroxy fatty acids with C14-C16chains.［Conclusion］ The combination of GC-MSMS technique and LAL test will improve the accuracy of measurement. The endotoxin concentration detected in this study could be a respiratory hazard to both humans and livestock animals.

livestock and poultry houses；airborne bacterial endotoxin；Limulus test；gas chromatography-tandem mass spectrometry；3-hydroxy fatty acids

S851.2+4

B

1005-944X（2016）09-0088-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.027

国家自然科学基金——动物舍微生物气溶胶传播模式研究（30571381）