γ-干扰素ELISA检测方法在牛结核病流行病学调查中的应用

吴亚文，王晓亮，张玉玲，王玉梅，李志红，张学军

（宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，宁夏银川　750011）



γ-干扰素ELISA检测方法在牛结核病流行病学调查中的应用

吴亚文，王晓亮，张玉玲，王玉梅，李志红，张学军

（宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，宁夏银川750011）

［目的］了解宁夏贺兰县奶牛结核病的流行情况，为制定宁夏地区牛结核病净化方案提供参考。［方法］2015年采用皮内变态反应和γ-干扰素ELISA检测方法，对宁夏贺兰县2个规模化奶牛场开展牛结核病流行病学调查，共检测奶牛2 230头。［结果］ 在2个规模化奶牛场累计检测出皮内变态反应阳性奶牛79头，皮内变态反应和γ-干扰素ELISA双阳性奶牛72头，双阳性率为3.23%（72/2 230）。［结论］ γ-干扰素ELISA检测方法准确度较高；在对牛群进行结核病检测时，先以皮内变态反应方法筛测，再结合γ-干扰素ELISA检测结果确诊，更有利于牛结核病的检测与净化。

牛结核病；γ-干扰素ELISA；皮内变态反应；流行病学调查

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种人兽共患慢性传染病，在全球范围内广泛流行［1］。结核分枝杆菌主要有牛型、人型和禽型3种，其中人型和牛型之间可以互相感染，禽型也可以感染牛和人类。牛结核病（Bovine Tuberculosis）在世界各地均有发生，世界动物卫生组织（OIE）在《陆生动物卫生法典》中将其列为须通报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。牛结核病作为一种重要的人兽共患病，不仅严重影响奶牛养殖业的发展，也是公共卫生的重大威胁。据统计，10%以上的人结核病由牛结核分枝杆菌引起［2］。因此掌握宁夏区牛结核病的现状，检测、淘汰感染奶牛具有重要意义。

1　实验材料

1.1试验动物

试验动物来自宁夏贺兰县A奶牛场1 300头奶牛、B奶牛场930头奶牛，合计2 230头。 所选牛群均为处于泌乳期的荷斯坦奶牛，年龄2～6岁。

1.2试验器材

电子数显游标卡尺、1 mL注射器、5 mL肝素理管、电子剃毛器、超净工作台、低温高速离心机、恒温培养箱、微量加样器、洗板机、酶标仪（美国伯乐BIO-IAD 680），其余均为常规实验室器材。

1.3试剂

国产牛型PPD（结核菌素纯蛋白衍生物、批号201308）购自哈药集团生物有限公司，50头份/瓶；牛结核分枝杆菌γ-干扰素ELISA检测试剂盒购自青岛瑞尔生物有限公司。

2　实验方法

2.1PPD单纯颈部皮内变态反应试验

单纯颈部皮试变态反应试验参照国家标准《动物结核病诊断技术》（GB/T18645—2002）进行。采用牛型PPD在奶牛颈部进行皮试变态反应试验，剂量为2 000国际单位（IU）/头，分别于注射前和注射后72 h测量皮肤厚度，计算皮厚差。结果判定：局部有明显的炎性反应，皮厚差≥4.0 mm为阳性；局部炎性反应不明显，4.0 mm≥皮厚差≥2.0 mm为疑似；无炎性反应，皮厚差＜2.0 mm为阴性。对第一次检疫结果为疑似的牛只，60天后进行复检［3］，结果仍为疑似的，60天后再复检，如仍为疑似，则判为阳性。

2.2γ-干扰素ELISA检测试验

牛尾静脉采集单纯皮内PPD变态反应试验阳性牛全血5 mL，置于肝素理抗凝管中，轻轻颠倒混匀，室温下送到实验室检测。在采血后8 h内进行刺激培养。将全血无菌分装24孔细胞培养板中（1.5 mL/孔，3孔/份样品），在对应的孔内无菌加入工作浓度的牛型PPD抗原、禽型PPD抗原、PBS液各100 μL，将各抗原与分装血液充分混匀后，把含有血液和抗原的细胞培养板放入37 ℃培养箱中孵育18～24 h。吸取300～400 μL上层血浆，转入1.5 mL离心管中，即为刺激产生的γ-干扰素上清，-20 ℃贮存待检（血浆2～8 ℃可保存一周，-20 ℃可保存一个月）。以牛结核γ-干扰素ELISA方法，检测牛全血上清中γ-干扰素，具体操作参照试剂盒说明书进行。结果判定标准：牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1判为阳性；牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值＜0.1或牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值＜0.1，则判为阴性。

3　结果

3.1PPD单纯颈部皮内变态反应试验结果

本次流行病学调查共检出皮内变态反应阳性牛79（65+14）头份，平均阳性检出率为3.58 %（79/2 230）（表1）。说明宁夏贺兰县的2个规模化奶牛场存在牛结核病。

表1　贺兰县奶牛皮内PPD变态反应检测结果

3.2γ-干扰素ELISA检测结果

对79份单纯皮内PPD变态反应试验阳性牛采集全血，用牛型PPD抗原、禽型PPD抗原、PBS液刺激后，收集上清，用牛结核分枝杆菌γ-干扰素ELISA检测试剂盒检测，发现平均阳性率为3.23%（72/2 230），检出阳性率低于皮内变态反应。说明皮内变态反应方法可能有部分非特异性反应存在，具体结果见表2。

表2　贺兰县奶牛γ-干扰素ELISA检测结果

4　讨论

到目前为止，牛结核病的检测方法大概可归为细菌学检测、分子生物学检测、免疫学检测3类。细菌学检测目前仍被认为是结核病确诊的金标准［4］，但由于牛分枝杆菌生长缓慢、分离率低，需要较高的生物安全措施，样品采集需要屠宰活牛，不适用于活畜检疫，因此严重影响了该方法的推广。分子生物学检测方法发展最快、特异性好，但灵敏度较差，且要求试验条件较高，不利于普及。牛结核病的免疫学检测方法（血清学检测和细胞免疫检测），一般认为其抗体检测敏感性较低。因此目前临床上使用最为广泛的是细胞免疫学诊断方法。细胞免疫学诊断方法适用于活畜的诊断，且对试验条件的要求不高，是一种适合推广的检测技术［5］。

单纯皮内变态反应使用的免疫学诊断试剂PPD是多种抗原的混合物，其所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和BCG所共有，因此存在交叉反应和非特异性反应。若单用该方法对检出的PPD阳性牛执行“检疫—扑杀”策略，可能会误杀假阳性牛。同时该方法敏感性较低，与感染动物接触的个体也会出现假阳性反应，在疫病早期阶段和急性感染期，还会出现假阴性反应，可能会忽略部分感染牛。此外，由于迟发性变态反应的影响，皮内变态反应在30天内不能进行复检，容易造成病原扩散和疫情处置延误。但其操作简便、技术要求简单、费用较低，对大量牛群的普查有一定的积极作用，可为进一步检测确认带来方便，减少检测的盲目性。因此，在对牛群进行结核病检测时，应先进行变态反应检测，检测结果阳性的牛先隔离，然后结合γ-干扰素ELISA方法检测的结果来综合判断。只有两者检测均为阳性的牛，才予以淘汰。

5　结论

采用单纯皮内变态反应和γ-干扰素ELISA试验对宁夏贺兰牛结核病进行血清流行病学调查，发现牛结核病在2个规模化奶牛场中均有存在；通过对比皮内变态反应和γ-干扰素ELISA方法检测的结果，发现γ-干扰素ELISA检测方法的准确度高，可作为辅助手段用于结核病的检测及净化。两者结合，既可以避免部分错筛带来的经济损失，又可以避免因漏检感染牛而导致的疫情扩散。只有通过该方法对牛群进行检测，确定并淘汰阳性牛，才能最终达到牛结核病的净化目的［6］。

［1］韩猛，张亮，王基隆，等. 山东省规模化奶牛场结核病与副结核病流行病学调查研究［J］. 中国农学通报，2014，14：10-13.

［2］陈祥，徐正中，时振华，等. γ-干扰素试验和皮试变态反应对检测奶牛结核病的比较［J］. 中国人兽共患病学报，2011（2）：97-100.

［3］周培校，李静，张鲁安，等. 牛结核γ—干扰素ELISA检测方法在检疫工作中的应用［J］. 中国动物检疫，2014（1）：67-71.

［4］张喜悦，呼西旦，杨经纬，等. γ-干扰素试验及比较皮试在结核污染牛群的应用研究［J］. 中国人兽共患病学报，2010（1）：53-56.

［5］王楠，王作友，江希玲，等. 四种不同检测方法在奶牛结核病诊断中应用的比较研究［J］. 吉林畜牧兽医，2012（11）：19-20.

［6］徐贤坤，熊毅，韦达有，等. γ-干扰素ELISA检测方法在广西牛结核病流行病学调查中的应用［J］. 南方农业学报，2013（4）：667-670.

（责任编辑：朱迪国）

Applications of IFN-γ ELISA for Epidemiological Survey of Bovine Tuberculosis

Wu Yawen，Wang Xiaoliang，Zhang Yuling，Wang Yumei，Li Zhihong，Zhang xuejun
（Ningxia Animal Disease Prevention and Control Center，Yinchuan，Ningxia 750011）

［Objective］ In order to investigate the prevalence status of bovine tuberculosis in Helan county and to provide a reference for purifi cation and comprehensive prevention and control of bovine tuberculosis in Ningxia. ［Methods］Using the tuberculin skin test（TST）and IFN-γ ELISA，2 230 cows from 2 large-scale dairy farms were detected.［Results］ 79 positive cows from 2 dairy farms were detected by TST，72 of them were still positive results tested by IFN-γ ELISA subsequently，the double positive rate by both methods was 3.23%（72/2 230）. ［Conclusion］ The results showed that the accuracy of bovine tuberculosis IFN-γ ELISA was relatively higher. TST conjunction with IFN-γ ELISA could be more conducive to bovine tuberculosis detection and purifi cation.

bovine tuberculosis；INF-γ ELISA；tubulin skin test；epidemiological survey

S851.3

B

1005-944X（2016）09-0078-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.024

宁夏回族自治区科技支撑项目（2013ZZN30）