利用质量控制图监控不同实验条件对布鲁氏菌试管凝集实验结果的影响

张锡全，饶 红，韩 玥

（北京出入境检验检疫局，北京 100026）



利用质量控制图监控不同实验条件对布鲁氏菌试管凝集实验结果的影响

张锡全，饶 红，韩 玥

（北京出入境检验检疫局，北京 100026）

运用建立的质量控制图，监控不同实验条件对布鲁氏菌试管凝集实验结果可能造成的影响。在每次日常检测时对标准阳性血清进行试管凝集实验并使用浊度仪测量其上清液的光密度（OD值），在收集足够有效数据后，绘制当前条件下的质量控制图。通过模拟日常实验条件下孵育温度、时间等容易产生偏离的条件，记录不同实验条件下标准阳性血清试管凝集实验后上清液的OD值，绘制控制用控制图。运用绘制的质量控制图对不同实验条件进行监控，发现孵育温度和孵育时间均对实验结果产生较大影响，从而导致失控。采用质量控制图对布鲁氏菌试管凝集实验进行监控，可提高质量监控的有效性、科学性。严格控制实验条件是保证实验结果的重要前提。

质量控制图；试管凝集；布鲁氏菌病；温度；孵育时间

布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌引起的人兽共患病，在全世界范围内流行严重，对人类健康构成了极大危害［1］。

抗体水平的检测常被用于布病的诊断和普查，方法包括试管凝集、平板凝集、补体结合、酶联免疫吸附实验等。其中，试管凝集实验结果仅依靠肉眼比较样品管与参照比浊管来判断，对实验人员要求很高，需要实验人员经验丰富，且实验结果易受人的主观影响。《检测和校准实验室能力认可准则》（CNAS-CL01：2006）5.9条款［2］、《＜检测和校准实验室能力认可准则＞应用要求》（CNAS-CL52：2014）5.9.2条款［3］都指出，实验室应使用质量控制图［4］等统计学技术方法对检测结果进行监控，以便及时发现检测结果的异常和存在的变化趋势。利用控制图判定哪些条件会对实验结果有影响，可以对日常检测工作中应特别注意的因素提供参考和警示。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

抗原（中国兽医药品监察所，201501）；标准品阳性血清（中国兽医药品监察所，2006）；标准品阴性血清（中国兽医药品监察所，201401）；1000L移液枪（eppendorf）；培养箱（3 M）；浊度仪（VITEK）；比浊用试管（VITEK）。

1.2操作方法

1.2.1供判定参照比浊管的配置。供判定参照比浊管按照《布鲁氏菌病实验室技术》GB/T 18646—2002［5］的要求配置。

1.2.2试剂符合性实验。标准阳性血清注明在1：2 400稀释时出现++。将标准阳性血清冻干粉溶于1 mL蒸馏水复原。将1 mL标准血清（4 000 IU/mL），加入到36.5 mL石碳酸生理盐水中，稀释成1：37.5的溶液，再梯度稀释为1：75、1：150、1：300、1：600、1：1 200、1：2 400、1：4 800、1：9 600、1：19 200的溶液。按照抗原说明书，将抗原稀释成1：20的工作液。将抗原工作液加入到上述梯度稀释的溶液中，加入等量的抗原后，血清稀释度分别为1：75、1：150、1：300、1：600、1：1 200、1：2 400、1：4 800、1：9 600、1：19 200、1：38 400。将上述加入了抗原的血清梯度稀释液置于37 ℃温箱，孵育24 h后与参照比浊管比浊。如果在1：2 400抗原稀释液中出现++，则证明购买的试剂的质量符合要求。

1.2.3建立质量控制图前期的数据收集。日常血清凝集实验和结果判定，按照《布鲁氏菌病实验室技术》（GB/T 18646—2002）的要求进行。在试管凝集实验孵育后，将1：2 400稀释度标准阳性血清的上清液加入到VITEK比浊用试管中，使用VITEK配套比浊仪读取并记录其OD值。

1.2.4利用建立的控制图监控不同实验条件对实验结果的影响。分别单独改变试管凝集实验孵育时间、孵育温度，其他实验条件不变，进行布鲁氏菌试管凝集实验。将不同实验条件下1：2 400稀释度标准阳性血清进行4个平行的试管凝集实验后的上清液加入到VITEK比浊用试管中，使用VITEK配套比浊仪读取并记录其OD值。设置的不同实验条件分别为：试管凝集孵育时间设定为24 h、28 h、29 h；孵育温度设定为37 ℃、25 ℃、15 ℃、42 ℃。

2　结果

2.1试剂符合性实验结果

通过肉眼将标准阴阳性血清与参照比浊管进行比较，在国际标准阳性血清1：2 400稀释时，显示++。同时使用比浊仪读取上清液的OD值。结果显示，标准阳性血清1：2 400稀释上清液OD值为0.67，参照比浊管50%凝集（++）上清液OD值为0.66；标准阴性血清各稀释度上清液OD值为1.12～1.22，参照比浊管0%凝集（-）上清液OD值为1.21。可见所购买的试剂质量符合要求。

2.2数据收集与离群值的剔除

当开始建立控制图时，如果收集的数据处于失控状态，那么依据这样的数据计算出的标准差会过大，导致控制限也会相应过大，出现漏检失控情况。依时间顺序收集1：2 400稀释度标准阳性血清试管凝集实验后的上清液OD值至少20组以上。当样本量在3≤n≤30时，在未知标准差情形且限定检出离群值的个数大于1的情况下，重复使用Dixon检验法［6］剔除离群值，选取最后20组数据绘制控制图。

在建立布病质量控制图的初期，收集了30个标准阳性血清试管凝集实验后上清液的OD值（表1），通过肉眼将标准阴阳性血清与参照比浊管进行比较，标准阳性血清在1：2 400稀释时均显示“++”。

样本量n=30，符合14≤n≤30，故检测高端离群值使用Dn=r22=（x（n）-x（n-2））/（x（n）-x3）计算统计量的值D30=0.62，而检测低端离群值使用D'n=r'22=（x（3）-x（1））/（x（n-2）-x（1））计算统计量的值D'30=0.067。当检测水平α=0.05时，临界值。因为，，判定x（30）为离群值。当剔除水平α*=0.01时，临界值。因为，，判定x（30）为统计离群值，应予以剔除。

剔除异常值后还剩余29个值，继续重复使用狄克逊（Dixon）检验法，对剩余的29个值进行判定，结果=0.415，所以在检测水平α=0.05时，不能继续检出离群值。

表1　标准阳性血清在1：2 400稀释度（++）时的OD值

2.3质量控制图的建立

将前期收集的运用狄克逊（Dixon）检验法剔除离群值后的29组数据，按时间顺序绘制质量控制图。这29组数据的“CL中心线=0.63”“UWL上 警 戒 限=0.704 066”“LWL下警戒限=0.555 934”“UCL上控制限=0.741 099”“LCL下控制限=0.518 901”。使用Excel制作质量控制图（图1）。

图1　Excel绘制出的标准阳性血清OD值控制图

经过《常规控制图》（GB/T4091—2001）中提到的8种检验验证，选取的这29个数据所建立的质量控制图是有效的。

2.4不同实验条件对实验结果的影响

参照比浊管、不同实验条件下标准阳性血清1：2 400稀释度试管凝集实验后上清液的OD值（表2、表3）。不同实验条件下标准阴性血清各稀释度试管凝集实验后上清液OD值在1.09～1.29，故阴性对照实验成立。

表2　参照比浊管各梯度OD值

表3　标准血清各稀释度OD值

沿用2.3中建立的控制图中的警戒限、控制限，将不同实验条件下标准阳性血清1：2 400稀释度试管凝集实验后上清液的OD值带入，绘成控制用控制图（图2）。

图2　Excel绘制出的不同实验条件下标准阳性血清OD值控制用控制图

如图2所示，15 ℃/24 h条件下标准阳性血清试管凝集实验后上清液OD值超出上控制限（UCL），显示失控；42 ℃/24 h条件下OD值超出下控制限（LCL），显示失控；25 ℃/24 h条件下OD值超出上控制限（UCL），显示失控，但超出UCL的程度小于15 ℃/24 h时的情况；37 ℃/24 h条件下OD值显示受控；37 ℃/28 h条件下OD值有两个平行超出下控制限（LCL），显示失控，另外两个平行在LCL附近；37 ℃/29 h条件下OD值超出下控制限（LCL），显示失控，且超出LCL的程度大于37 ℃/28 h时的情况。可见，孵育温度和孵育时间均对布鲁氏菌试管凝集实验的结果有影响。

3　讨论

3.1当实验条件高于或低于标准规定时，会导致假阳性或假阴性结果的出现

标准规定的实验条件是37～40 ℃孵育24 h。当孵育温度低于该温度范围时（如15 ℃、25 ℃），试管凝集反应减退甚至停滞，且其受影响的程度随着孵育温度的降低而增强，出现假阴性的结果，导致漏检。当孵育温度高于该温度范围时（如42 ℃），试管凝集反应加剧，甚至下一个稀释度也出现了凝集反应，出现假阳性的结果，导致误检。当孵育时间高于规定的24 h时（如28 h、29 h），试管凝集反应加剧，下一个稀释度也出现了凝集反应，同样容易导致误检。

3.2试管凝集实验中应特别关注对温度、孵育时间的控制

从失控情况的原因分析来看，温度、孵育时间等条件对布鲁氏菌试管凝集实验的结果影响很大，这两个条件可以看作是该实验的关键控制点，在日常工作中应特别注意。

3.3应采取有效措施，保证按标准规定条件进行试验

培养箱性能的稳定性直接影响孵育温度。因此实验室要严格按照设备需求，定期（如1年）对设备进行校准。此外每天应安排人员监控并记录培养箱温度。针对孵育时间，需要对所有实验人员依据检测标准进行严格细致地培训，强调影响实验结果的关键条件控制，同时设计原始记录时应考虑到要便于记录开始和结束孵育的时间，从记录层面进一步控制孵育时间的准确稳定。

3.4质量控制图监控试管凝集实验具有重要意义

质量控制图用于动物检疫领域，尤其对布鲁氏菌试管凝集实验这类半定量实验，目前还未见相关报道。但质量控制图在应用中取得了理想的效果，能够监控日常实验中的失控结果和变化趋势，且对与温度、孵育时间等关键控制点，反应敏感。

3.5实验条件的稳定是制作和应用质量控制图的前提

应用质量控制图时，应采用并严格按照标准检测方法；应使用经过校准且性能稳定的仪器设备；应由固定且有经验的实验员完成；应在使用前对试剂进行验证。

3.6在应用质量控制图时，应了解所选实验的关键控制点

了解所选实验关键控制点的目的是便于在观察到控制图的异常波动和变化趋势时，可以追溯实验过程，找到问题所在，并及时消除存在的异常因素。

［1］郑世军.现代动物传染病学［M］.北京：中国农业出版社，2013：21-26.

［2］ 中国合格评定国家认可委员会. 检测和校准实验室能力认可准则：CNAS-CL01：2006［S］. 北京：中国合格评定国家认可委员会，2006.

［3］ 中国合格评定国家认可委员会. ＜检测和校准实验室能力认可准则＞应用要求：CNAS-CL52：2014 ［S］. 北京：中国合格评定国家认可委员会，2014.

［4］国家质量技术监督局. 常规控制图：GB/T 4091—2001［S］. 北京：中国标准出版社，2001.

［5］国家质量监督检验检疫总局. 布鲁氏菌病实验室技术：GB/T 18646—2002［S］. 北京：中国标准出版社，2002.

［6］ 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.数据的统计处理和解释—正态样本离群值得判断和处理：GB/T 4833—2008［S］. 北京：中国标准出版社，2008.

（责任编辑：朱迪国）

Using the Quality Control Chart to Monitor the Impact Causing by Different Experimental Conditions for Detecting Brucellosis by Tube Agglutination

Zhang Xiquan，Rao Hong，Han Yue
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026）

Experimental results are infl uenced by test conditions in some extent. In this study，quality control chart was applied to monitor the impact causing by different test conditions for detecting brucellosis by tube agglutination. In order to draw quality control chart，standard positive serum in everyday routine assay was used to conduct tube agglutination test，so as to obtain suffi cient data by measuring the OD values of supernate by turbidity meter. Through simulating such easily deviating conditions as temperature and incubation time，the above mentioned method was used to draw quality control chart under the current condition. It was found that both temperature and incubation time affected experimental results greatly，which could lead to lose control of test results. In conclusion，using quality control chart to monitor detection of brucellosis by tube agglutination was able to improve the monitoring quality effectively and scientifi cally. Strict control of the experimental conditions is an important premise to guarantee the results of the experiments.

quality control chart；tube agglutination；brucellosis；temperature；incubation time

S851.3

B

1005-944X（2016）09-0081-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.025

国家质检总局科技计划项目：质量控制图在动检血清学检测应用的示范性研究（2015IK009）

饶 红