滩羊胎儿弯曲杆菌的分离鉴定

吴亚文，张玉玲，李志红，王玉梅，张 雯，王晓亮，张和平，张学军，杨佳冰，李莉娟，赵 燕

（宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，宁夏银川　750011）



滩羊胎儿弯曲杆菌的分离鉴定

吴亚文，张玉玲，李志红，王玉梅，张 雯，王晓亮，张和平，张学军，杨佳冰，李莉娟，赵 燕

（宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，宁夏银川750011）

［目的］ 对一规模化养殖场滩羊流产的原因进行确诊，为流产羊的疫病诊断和防控提供建议。［方法］无菌采集流产胎儿血性腹水和流产母羊阴道分泌物进行细菌培养、分离和鉴定。［结果］ 分离到2株病原菌，经形态特性、培养特性及生理生化特性观察，鉴定为胎儿弯曲杆菌胎儿亚种；动物实验表明，其对小白鼠有很强的致病性。［结论］ 致病性胎儿弯曲杆菌胎儿亚种是造成该羊场发生大面积流产的主要病原。

滩羊；胎儿弯曲杆菌；分离鉴定

胎儿弯曲杆菌胎儿亚种通常寄居于牛、羊、猪、鸟类和人的肠道中，有些菌株能从肠道经血液进入内脏，然后在胎盘繁殖，从而引起动物流产。胎儿弯曲杆菌为革兰氏染色阴性，呈螺旋状或“S”状，在一些老龄培养物上可出现球状或球杆状，不形成芽胞和荚膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈快速螺旋状穿梭运动。该亚种菌落小而圆，37 ℃培养48 h 直径仅1～2 mm。菌体细胞较空肠及大肠弯曲杆菌大，末端较钝，长短不一，短者仅及长者的一半，类似于弧菌。由该菌引起的母羊流产多发生于妊娠后3 个月，流产率可达25% 以上。母羊流产后，因胎衣不下引起子宫内膜炎、长期不孕等而被淘汰，给养羊业带来了一定的经济损失［1］。

2015年1月份，宁夏贺兰县某规模化羊场的1 200只待产滩羊（2014年7月购于内蒙古临河区）出现了个别滩羊流产的现象，有的发生在怀孕2～3月，有的发生在预产期前2～3天。截止到1月22日，有8只滩羊流产。最后，通过病原微生物的实验室诊断，确定了此次滩羊流产的主要病因。采取控制措施1个月后，滩羊流产状况逐步好转，病情基本得到控制。

1　材料

1.1病料

宁夏贺兰县某规模化羊场发生流产的1只1岁滩羊和1只流产死亡的胎儿。

1.2实验动物

昆明系小白鼠8只（体重为18～20 g/只），雌雄不限，购自宁夏医科大学实验动物中心。

1.3主要仪器及试剂

厌氧培养罐、布鲁氏菌鉴别培养基（可用于弯曲杆菌的培养），购自青岛海博生物技术有限公司。5% 兔血营养琼脂培养基、生理生化鉴定用培养基，均按参考文献［2-3］中的方法制备。试管、生理盐水、革兰氏染液等常规实验室器材，均由宁夏动物疾病预防控制中心实验室提供。

2　方法

2.1样品采集

2.2.1流产胎儿血性腹水的采集。用无菌注射器抽取流产胎儿的血性腹水（图1）。

图1　采集流产胎儿血性腹水

2.2.2流产滩羊阴道分泌物的采集。用0.1%新洁尔灭清洗流产滩羊外阴部，将灭菌棉拭子缓慢插入流产滩羊阴道内，转动并停留1 min后取出，置于灭菌试管内。

2.2病料涂片镜检

将采集到的流产羔羊血性腹水、流产滩羊阴道内分泌物分别进行涂片、革兰氏染色、镜检。

2.3病原菌的分离及纯化

将采集的样品接种于布鲁氏菌鉴别培养基，37 ℃混合气体（质量百分比为3.5% O2、10% CO2、86.5% N2）培养，观察细菌生长情况及菌落特征。48 h后，如果有菌落生长，挑取单个菌落，涂片，革兰氏染色，镜检。

2.4培养特性及生理生化特性鉴定

2.4.1培养特性观察。挑取布鲁氏菌鉴别培养基上单个菌落进行1%甘氨酸生长试验、3.5%氯化钠生长试验、1%胆汁生长试验以及25 ℃、42 ℃等不同温度的生长试验［3］。将分离菌接种于培养基后，在微需氧条件下培养72 h，观察并记录结果。

2.4.2生理生化特性观察。参照文献［3］的方法进行过氧化氢酶、氧化酶试验，硫化氢产生试验和马尿酸水解试验。

2.4.3运动力检查。将灭菌生理盐水滴于载玻片上，挑取纯培养的单个菌落，与生理盐水混匀后加盖玻片，在油镜下观察其运动性［4-5］。

2.5溶血性试验

将胎儿弯曲杆菌接种于5%兔血琼脂平板，37 ℃培养48 h，观察是否有溶血现象。

2.6动物感染试验

将分离的2株菌，用灭菌生理盐水稀释，取菌液后比浊为1.32×108个/mL，按0.5 mL /只腹腔注射接种于4只健康小白鼠；同时用生理盐水作对照，按0.5 mL /只腹腔注射接种于4只健康小白鼠。正常饲喂和饮水，记录小白鼠的精神状态、外观体况、发病和死亡情况。连续观察7 d，然后对死亡小白鼠进行剖检观察。无菌挑取其心脏、肝脏、脾脏、胃等脏器于布鲁氏菌鉴别培养基划线培养，进行革兰染色。将结果与初始细菌的生化信息进行比对，确定菌株的致病性。

3　结果与分析

3.1涂片镜检结果

病料及纯培养物革兰氏染色，涂片镜检，均可见“逗点”型、“S”型、“海鸥展翅”型和少数螺旋状的无芽孢革兰氏阴性杆菌。

3.2分离菌形态及生化特性

3.2.1分离菌的形态学特征。从流产胎儿的血性腹水、流产滩羊生殖道分泌物中分离到2株纯细菌培养物。在5% 兔血液培养基培养上，菌落为圆形、光滑、半透明、周边整齐，没有溶血现象。用布鲁氏菌鉴别培养基培养过程中，可见分离菌在微需氧条件下25 ℃生长，42 ℃不生长。菌落特征为圆形、光滑、湿润、半透明，边缘整齐（图2）。镜检观察可见培养物为弯曲而细长的革兰氏阴性杆菌，多呈“逗点”状、“S”型和“海鸥展翅”状（图3）。

图2　布鲁氏菌鉴别培养基上菌落形态

图3　胎儿弯曲杆菌革兰氏染色油镜下形态

3.2.2分离菌的生理生化特性。分离菌及从试验动物回收到的细菌均表现出一致的生化特性。分离株过氧化氢酶、氧化酶试验呈阳性；分离菌株在三糖铁培养基上没有产生硫化氢；在含有1% 甘氨酸、1%胆汁的巯基乙酸肉汤中生长良好与欧都·吾吐那生［6］的报道稍有差别；在3.5% NaCl中未生长；马尿酸钠水解试验阴性；运动力检查试验，油镜观察见其呈螺旋式运动。

3.3分离菌致病性

在4只小白鼠的腹腔内注入纯培养物后，小白鼠背毛逆立、精神萎靡，第3天开始死亡。到第5天，共有3只小白鼠死亡，剖检试验组小鼠，均可见肝脏和脾脏肿大；从死亡小白鼠的心脏、肝脏、脾脏中均能分离到疑似纯培养物，经鉴定表明与接种的菌株具有相同的生理生化及培养特性。动物试验表明，小白鼠的发病是由目标菌株引起的。对照组小白鼠未表现异常。

4　讨论

综合上述各项实验室诊断结果，可以确定从流产胎儿腹水内、流产滩羊阴道分泌物中分离到的细菌，其形态、培养特性、生物学特性及溶血性均符合胎儿弯曲杆菌胎儿亚种的培养及生化特性，因此可认为引起此次滩羊流产的病原菌为致病性胎儿弯曲杆菌胎儿亚种。

动物试验结果表明分离株具有较强的致病性。腹腔注射能引起小白鼠死亡，且能从其心脏、肝脏、脾脏中回收到与其生物学特性一致的病原菌，完全符合科赫法则。

胎儿弯曲杆菌主要在分娩时通过流产物传播。所以在产羔季节，养殖场应做好相关消毒工作。对流产滩羊进行隔离治疗，切断传染源。流产后的滩羊应至少隔离饲养1个月后再混群［7］。病羊不允许出售，以免扩大传染。及时清除流产胎儿和阴道分泌物，彻底消毒污染物，如粪便、垫草等。

［1］ 武宁，张志平. 羊胎儿弧菌病的诊断报告［J］. 畜牧与饲料科学，2012，33（8）：127-128.

［2］ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法：GB/T 18653—2002［S］. 北京：中国标准出版社，2002.

［3］ 何晓青. 卫生防疫细菌检验［M］. 南昌：新华出版社，1989.

［4］ 朱战波，崔玉东，侯喜林，等. 奶牛流产胎儿弯曲菌的分离鉴定［J］. 中国兽医杂志，2004（12）：28-30.

［5］ 谢奉瑜，魏革，王哲，等. 胎儿弯曲菌空肠亚种的分离与鉴定［J］. 黑龙江医药，1982（1）：16-17.

［6］ 欧都·吾吐那生，齐亚银，李岩，等. 羊流产胎儿弯曲杆菌的分离鉴定及动物感染试验［J］. 黑龙江畜牧兽医，2015（20）：94-95.

［7］ 田树军，赵秀英，王鹏飞. 母羊流产原因分析及防治措施［J］. 河北畜牧兽医，2002，18（4）：32.

（责任编辑：朱迪国）

Isolation and Identifi cation of Campylobacter fetus from Tan Sheep

Wu Yawen，Zhang Yuling，Li Zhihong，Wang Yumei，Zhang Wen，Wang Xiaoliang，Zhang Heping，Zhang Xuejun，Yang Jiabing，Li Lijuan，Zhao Yan
（Ningxia Center for Animal Disease Control and Prevention，Yinchuan，Ningxia 750011）

［Objective］ To ascertain the cause of abortion in Tan sheep population so as to provide advice for diagnosis，prevention and control of Campylobacter fetus infection. ［Methods］ Samples from fetal bloody ascites and aborted ewes vaginal secretions were aseptically collected for bacterial culture，isolation and identifi cation of bacterial testing.［Results］ Two strains of pathogenic bacteria were isolated，which were determined as Campylobacter fetus subspecies fetus by observing the morphological characteristics，cultural characteristics and physiological and biochemical characteristics. The isolates had strong pathogenicity for mice. ［Conclusion］ The main pathogens leading to many Tan sheep aborted were the pathogenic Campylobacter fetus subspecies fetus.

Tan sheep；Campylobacter fetus；isolation and identifi cation

S858.26

B

1005-944X（2016）09-0085-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.026

宁夏回族自治区科技支撑项目（2013ZZN30）