推拿对坐骨神经损伤大鼠层黏连蛋白表达的影响*

张林峰，于天源，潘璠，鲁梦倩，冼思彤，崔旻珍，姚斌彬，郭鑫，贾文端，陶艳红，马驰

北京中医药大学，北京100029

推拿对坐骨神经损伤大鼠层黏连蛋白表达的影响*

张林峰，于天源△，潘璠，鲁梦倩，冼思彤，崔旻珍，姚斌彬，郭鑫，贾文端，陶艳红，马驰

北京中医药大学，北京100029

目的：探讨推拿对坐骨神经损伤（SN I）大鼠运动功能及脊髓腹角、损伤点处层黏连蛋白（LN）表达的影响。方法：将SD大鼠48只随机分为正常组、假手术组、模型组、模型对照组、推拿组，造模采用坐骨神经损伤模型，以按摩推拿手法模拟仪进行手法干预，观察各组大鼠斜板实验评分及L3～5节段脊髓和患侧坐骨神经处LN的表达情况。结果：造模7天后，模型组大鼠的斜板实验评分与同期正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；模型组LN在脊髓腹角和坐骨神经处的表达与同期正常组相比升高（P＜0.05）；LN在正常组、模型组中脊髓腹角的表达量较坐骨神经中的表达明显增高（P＜0.01）。在推拿治疗20次后，模型组、模型对照组、推拿组斜板实验评分与同期正常组相比有差异（P＜0.05），推拿组斜板实验评分与同期模型组相比升高（P＜0.05）；同时，模型组、模型对照组、推拿组LN在脊髓腹角和坐骨神经处的表达均高于同期正常组（P＜0.01），推拿组LN在脊髓腹角和坐骨神经损伤处的表达与同期模型组比较明显升高（P＜0.01）；LN在正常组、推拿组中脊髓腹角的表达量明显较坐骨神经中的表达高（P＜0.01）。结论：推拿可以上调周围神经损伤大鼠LN在脊髓腹角和坐骨神经处的表达，加快损伤神经的修复，改善SN I大鼠的运动功能。

坐骨神经损伤；层黏连蛋白；推拿治疗；机理研究

周围神经损伤是临床常见病，严重影响患者的生活质量。当神经损伤后，远端的雪旺细胞（SC）很快增殖，形成雪旺氏细胞索（Bungner带），再生轴突沿着SC细胞索生长，进而促进细胞再生［1-2］；同时周围神经损伤后层黏连蛋白（Laminin，LN）分泌水平增高，可促进损伤神经修复［3］，进一步研究LN发现LN不仅能够引导神经趋向性生长，促进轴突生长成熟、引导神经方向性生长，还能维持正常的神经再生微环境、增强细胞间黏附，促进损伤神经的修复［4］。本研究采用SNI大鼠模型模拟临床周围神经损伤症状，以推拿作为干预手段，通过行为学和免疫组化方法检测脊髓腹角、坐骨神经损伤点处LN的变化，研究推拿起效与LN表达量间的关系，探讨推拿治疗坐骨神经损伤的机制。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级SD大鼠48只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（京）2012-0001，体质量（180±10）g，雄性（因雌激素能促进周围神经损伤修复）［5］。

1.2动物分组利用随机数字表制定随机分组方案，48只大鼠进行随机分组，分出正常组12只，假手术组12只，模型组24只，第一次取材后将模型组剩余动物再次随机分为模型组、模型对照组、推拿组各6只。

1.3仪器与试剂

1.3.1实验仪器按摩推拿手法模拟仪（中国人民共和国发明专利号：200710187403.1）；RY-32型热源自动测试仪；SKP-02.600型电热恒温培养箱；LS-100型病理石蜡包埋机（沈阳市龙首电子仪器有限公司）；石蜡切片机（北京弘泰嘉业科技发展有限公司Finesse 325）；显微镜（麦克奥迪BA400）等。

1.3.2试剂10%水合氯醛、碘伏消毒液、0.9%氯化钠溶液、4%多聚甲醛溶液、0.1 mo1/L磷酸缓冲液、二甲苯、石蜡、无水乙醇、10%山羊血清、兔抗LN抗体（Abcam，ab65986）、非免疫山羊血清（编号：NIS-0081），生物素标记的山羊抗兔（编号：IB-0061）。

1.4实验方法

1.4.1模型制备坐骨神经夹持损伤模型制备：造模前1天在手术区即患侧（右侧）下肢臀股交界处剪毛，脱毛；水合氯醛麻醉；经手术区常规消毒；于患侧臀股交界处切开皮肤；止血和钝性分离后；暴露梨状肌下缘及坐骨神经；用10号持针钳，夹持梨状肌下缘5 mm处的坐骨神经，满扣（经过测量压力为5 kg），时间为5秒，造成长约2 mm的损伤点；逐层缝合。假手术组只暴露坐骨神经即可，然后逐层消毒、缝合。

1.4.2干预方法于造模后第7天开始干预。用“推拿手法模拟仪”依次刺激推拿组大鼠手术侧殷门、承山、阳陵泉3穴；施行点法、拨法、揉法3个手法；刺激力量为4 N。每法每穴1分钟；每只总计9分钟。正常组、假手术组、模型组不做特殊干预；模型对照组大鼠每天每只束缚9分钟。1次/d，每治疗10次休息1天，共治疗20次。

1.5检测指标分别于造模后7天从正常组、假手术组、模型组各取6只大鼠，干预20次后从正常组、假手术组、模型组、模型对照组、推拿治疗组各取6只大鼠，采用盲法进行行为学和免疫组化检测。

1.6行为学检测方法

1.6.1斜板实验按Riv1in法制倾斜板，在室温安静状态下，将大鼠头向前，身体纵轴与斜板纵轴平行放置，角度从小到大渐增，直至大鼠停留5秒而不跌落的最大角度做斜板实验行为学评分，每只大鼠重复测量3次，取平均值。

1.6.2免疫组化检测4%多聚甲醛灌注固定后于脊髓和坐骨神经取材，石蜡包埋，切片脱蜡，3% H2O2室温孵育12分钟，微波抗原修复10分钟，10%山羊血清封闭室温孵育15分钟，再加（1∶100）兔抗LN抗体4℃过夜，恢复室温1小时，加山羊抗兔IgG抗体37℃孵育20分钟，滴加SABC 37℃孵育20分钟，DAB显色剂显色，流水冲洗，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封固。每组染色过程中均设定并加一抗的空白对照染色。并用Image-Pro P1us 6.0图像软件计算光密度值。

1.7统计学方法数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间比较采用方差分析，组间多重比较采用SNK-q法，不满足方差分析条件时采用秩和检验（Kruska1-Wa11is法等），P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1行为学造模7天后，模型组大鼠的斜板实验评分与同期正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；推拿治疗20次之后，模型组、模型对照组、推拿组斜板实验评分与同期正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；推拿组斜板实验评分与同期模型组相比升高（P＜0.05），见表1。

表1　斜板实验结果（±s）

表1　斜板实验结果（±s）

注：与同期正常组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与同期模型组比较，△表示P＜0.05。

组别只数斜板实验/度造模后7天治疗20次正常组646.75±3.7246.71±1.81假手术组642.42±1.7245.91±2.63模型组636.50±1.64**39.50±0.71*模型对照组6-38.75±1.29*推拿组6-43.25±1.64*△

2.2免疫组化脊髓腹角、坐骨神经处LN免疫组化结果表达：经Image-ProP1us 6.0平均光密度检测，造模后7天，模型组LN在脊髓腹角和坐骨神经处的表达与同期正常组相比升高（P＜0.05）；正常组、模型组LN在脊髓腹角的表达明显较坐骨神经中的表达量高（P＜0.01）。推拿治疗20次后，模型组、模型对照组、推拿组LN在脊髓腹角和坐骨神经处的表达均高于同期正常组（P＜0.01），推拿组LN在脊髓腹角和坐骨神经损伤处的表达与同期模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；正常组、推拿组LN在脊髓腹角的表达较坐骨神经中的表达量高（P＜0.01），见表2—4、图1—4。

表2　各组大鼠不同时期脊髓腹角处LN平均光密度值（±s）

表2　各组大鼠不同时期脊髓腹角处LN平均光密度值（±s）

注：与同期正常组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与同期模型组比较，△△表示P＜0.01。

组别只数造模后7天治疗20次正常组60.024±0.0030.025±0.003假手术组60.023±0.0020.019±0.005模型组60.040±0.005*0.051±0.002**模型对照组6-0.050±0.022**推拿组6-0.100±0.008**△△

表3　各组大鼠不同时期坐骨神经处LN平均光密度值（±s）

表3　各组大鼠不同时期坐骨神经处LN平均光密度值（±s）

注：与同期正常组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与同期模型组比较，△△表示P＜0.01。

组别只数造模后7天治疗20次正常组60.0028±0.00080.0033±0.0013假手术组60.0032±0.00090.0032±0.0010模型组60.0060±0.0006*0.0069±0.0016**模型对照组6-0.0075±0.0006**推拿组6-0.0110±0.0008**△△

表4　不同时期脊髓腹角、坐骨神经处LN平均光密度值（±s）

表4　不同时期脊髓腹角、坐骨神经处LN平均光密度值（±s）

注：**表示脊髓腹角与坐骨神经组内比较P＜0.01。

组别只数造模后7天治疗20次坐骨神经脊髓腹角坐骨神经脊髓腹角正常组60.0028±0.00080.024±0.003**0.0033±0.00130.025±0.003**模型组60.0060±0.00060.040±0.005**--推拿组6--0.0110±0.00080.100±0.008**

图1　各组大鼠造模后7天LN在脊髓腹角处免疫组化结果（×400）

图2　各组大鼠推拿治疗20次时LN在脊髓腹角处免疫组化结果（×400）

图3　各组大鼠造模后7天LN在坐骨神经处免疫组化结果（×400）

图4　各组大鼠推拿治疗20次时LN在坐骨神经处免疫组化结果（×400）

3　讨论

推拿对坐骨神经损伤有显著疗效，推拿能够促进坐骨神经损伤大鼠行为学的改善和形态学的修复［6］，能促进周围神经损伤后修复再生，其机理可概括为以下3点：1）调控内源性营养因子的表达：如促进NGF［7］、GAP-43［8］、bFGF［9］、降低P75NTR受体的释放［7］；2）改善损伤局部微循环：促进轴浆运输功能的恢复［10］以及细胞骨架蛋白［11］，降低损伤组织MBP含量的表达［12］，促进损伤轴突的修复；3）信息调控，整体治疗：通过中医推拿的整体治疗作用，加强对神经递质分泌、释放、作用等的调控，促进损伤神经修复再生。

近年关于LN的研究越来越广泛，其在神经修复方面的作用也越来越受到人们的重视，LN是一种广泛存在于多种动物及人类细胞基底膜基质中的蛋白，其发挥神经损伤修复的机理可以概括为：1）促进SC分裂、增殖、迁移和髓鞘化，促进有髓神经纤维的再生［13］。SC细胞不仅能够分泌基底膜成分，形成基底膜，还能促进神经纤维的再生和髓鞘化的形成，在损伤神经的修复过程中起重要作用。陈雪等［14］在施万细胞的层黏连蛋白表达变化及两者关系的初步研究中发现LN作为基质中一种多功能的蛋白质分子，能选择性地结合到SC表面，促进SC合成细胞基底膜成分，并在其黏附过程中发挥作用；2）促进轴突的再生［15］。LN可增加细胞间黏附作用，保持生长锥前进运动的稳定性，防止其回缩，进而促进轴突的再生，因而LN是调控轴突生长成熟不可缺少的物质之一［16］；3）具有再生轴突导向作用，引导神经再生方向［17］。LN分布在基底膜的细胞侧，能够调控轴突的生长行为，其引导作用是神经轴突完全修复的关键因素之一。王国英等［17］在研究SC基底膜成分LN在神经再生领域的实验时发现对照组约92%的新生轴突选择基底膜管内侧生长，而实验组（LN失活组）只有48%的轴突长在基底膜管外的结缔组织中，它们并不选择基底膜管作为再生通路，表明LN可为轴突提供方向性生长信息物质；4）引导再生轴突生长锥的方向［18］：神经损伤后，细胞的黏附和迁移能力是伤口愈合的重要环节，周围神经损伤后，SC与细胞基底膜的黏附及细胞移行可使生长锥保持稳定性，促进轴突沿着基质生长，并引导神经纤维定向生长，最终利于神经再生［19-20］。李军［21］在使用外源性LN研究SC与轴突在周围神经再生微环境间的关系时发现，再生神经纤维错向生长的比例明显少于其他组，说明LN能够引导再生轴突生长锥的方向，发挥积极正向引导作用；5）为周围神经再生提供了良好的微环境［22］。LN可促进SC细胞的增殖及各种营养因子的分泌，改善神经自身的微环境。

本实验中推拿手法直接作用于殷门、承山和阳陵泉3穴，采用中医循经取穴原则，殷门在大腿后，位于足太阳膀胱经承扶与委中连线上，解剖学上属坐骨神经干位置；阳陵泉是足少阳胆经的穴位，位于坐骨神经的分支腓总神经上；承山属足太阳膀胱经穴位，位于坐骨神经的分支胫神经上；从神经支配区域分析：此3穴分别是坐骨神经、胫神经和腓总神经所支配的肌肉区--股二头肌、腓肠肌和胫前肌。正常的运动功能主要在神经（传导通路）和肌肉（效应器）的相互协调下完成。选穴体现了中、西医理论相结合的特点，实验中通过行为学斜板实验评分，以及脊髓腹角免疫组化检测，从运动功能方面评价大鼠恢复情况：发现推拿组大鼠的斜板实验评分优于模型组和模型对照组（P＜0.05），而本实验中所选取的斜板实验评分和脊髓腹角LN免疫组化都是评价其运动功能损伤的指标，推拿干预不仅能上调脊髓腹角LN的表达量，还能上调外周神经损伤处LN表达量，改善中枢与外周运动通路进而发挥其促进损伤神经运动功能修复的作用，这可能是推拿促进SNI大鼠运动功能修复的机理之一。

李军［21］在研究周围神经损伤后雪旺细胞与轴突再生关系时发现，外源性LN组的再生有髓神经纤维计数、横截面积、等效直径和髓鞘厚度均优于丝裂霉素组和生理盐水组及其组合，说明增加外源性LN，提高组织内LN含量能够促进损伤神经的修复；楚燕飞等［22］在研究大鼠坐骨神经损伤后雪旺细胞、LN动态变化时发现LN的表达依赖于SC的增殖，所以推测LN表达量的增加可能是因为推拿促进SC细胞增值，SC促进LN表达量的增加共同介导了神经损伤的修复过程。本研究推拿组LN在脊髓腹角和坐骨神经损伤处的表达与同期模型组比较有差异（P＜0.01），说明推拿能够促进坐骨神经损伤大鼠LN的表达，促进损伤神经的修复，其可能机理为：坐骨神经损伤后其组织虽能分泌少量的LN，但在推拿干预后损伤组织LN的表达量明显增加；同时本研究还发现造模7天后LN在正常组、模型组及治疗20次后LN在正常组、推拿组中脊髓腹角的表达量均较坐骨神经中高（P＜0.01）；即坐骨神经损伤的情况下LN在脊髓腹角处的高含量以及推拿干预后LN在脊髓腹角处的高表达，间接反映LN发挥主导作用的部位在中枢，及推拿干预可促进中枢分泌更多的LN，推测LN治疗作用的发挥可能是由中枢介导和调控外周一起完成，并共同发挥其促进损伤神经功能修复的作用。LN在损伤大鼠组织的表达量增加，不仅能发挥促进SC分裂、增殖、迁移和髓鞘化作用和髓神经纤维的再生，还能发挥其轴突生长导向作用，促进轴突的生长，给损伤神经提供良好的再生微环境，推断推拿干预下LN在中枢与外周的高表达，进而改善脊髓至外周通路的功能可能是其修复损伤坐骨神经的机理之一。但关于LN在中枢与外周通路如何具体发挥效应还需要进一步的探索。

本研究以推拿作为干预手段，通过行为学和免疫组化方法检测脊髓腹角、坐骨神经损伤点处LN表达量的变化，探究推拿起效与LN间的关系，结果表明推拿能够改善SNI大鼠的运动功能，上调脊髓腹角和坐骨神经处LN的表达量，其中脊髓腹角处LN的表达量明显高于坐骨神经处，表明中枢调控外周在损伤修复中发挥主要作用，可改善中枢外周通路的功能，在促进损伤神经修复的过程中扮演重要角色。

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The Effects of Massage on the Expression of Laminin of the Rats with Sciatic Nerve Injury

ZHANG Linfeng，YU Tianyuan△，PAN Fan，LU Mengqian，XIAN Sitong，CUI Minzhen，YAO Binbin，GUO Xin，JIA Wenduan，TAO Yanhong，MA Chi
Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Objective:To explore the influence of massage on the expressions of laminin（LN）in the damage point and cornu ventrale medullae spinalis，motor function of the rats with sciatic nerve injury（SCI）.Methods: Forty-eight rats were randomized into the normal group，sham operation group，the model group，model control group and massage group，the rat model with SNI was prepared and intervened with massage manipulation simulator，LN expressions of sciatic nerve in the affected limb and L3～5spinal cords，and the scores of inclined plate test were observed.Results:After the models were prepared in seven days，there was significant difference when the model group was compared with the normal group at the same period in the scores of inclined plate test（P＜0.01）；LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis and sciatic nerve in the model group raised compared with the normal group at the same period（P＜0.05）；LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis in the normal group and the model group improved notably compared with LN expressions in sciatic nerve obviously（P＜0.01）.After massage for 20 times，there was the difference existed in the comparison of the scores of inclined plate test when the model group，model control group，massage group were compared with the normal group at the same period（P＜0.05），the scores of inclined plate test raised in the massage group compared with the model group（P＜0.05）；at the same time，the model group，model control group and the massage group were higher than the normal group in LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis and sciatic nerve（P＜0.01），LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis and sciatic nerve in the massage group raised obviously compared with the model group at the same period（P＜0.01）；LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis were higher than LN expressions in sciatic nerve in the normal group and the massage group significantly（P＜0.01）.Conclusion:Massage could up-regulate LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis and sciatic nerve of the rats with peripheral nerve injury，speed up the recovery of damaged nerve and improve the motor function of SNI rats.

scatic nerve injury；laminin；massage；mechanism study

R244.1

A

1004-6852（2016）05-0012-06

2015-06-24

国家自然科学基金资助项目（编号81373759）；博士点基金资助项目（编号20130013110016）；北京市自然基金资助项目（编号7142097）。

张林峰（1990—），男，在读硕士研究生。研究方向：针灸推拿治疗周围神经损伤的机理研究。

于天源（1965—），男，博士研究生导师，博士学位，教授，主任医师。研究方向：针灸推拿治疗周围神经损伤的机理研究。