痹痛合剂对OA大鼠关节软骨形态学变化及软骨细胞Bcl-2基因表达的影响*

李素明，杭柏亚

南京市中医院，江苏南京210001

痹痛合剂对OA大鼠关节软骨形态学变化及软骨细胞Bcl-2基因表达的影响*

李素明，杭柏亚△

南京市中医院，江苏南京210001

目的：观察痹痛合剂对骨性关节炎（OA）关节软骨细胞形态学变化的影响并探讨其可能的作用机制。方法：将SD雄性大鼠64只随机分为假手术组（A组）、模型组（B组）、硫酸氨基葡萄糖组（C组）和痹痛合剂组（D组），A组行假手术，B、C、D组采用Hulth法复制OA模型，A组常规饲养，其余各组术后分别加服生理盐水，硫酸氨基葡萄糖溶液和痹痛合剂。术后第8周处死，分别大体观察、光镜400×和电镜下观察关节软骨细胞形态学变化，原位杂交法检测关节软骨细胞中Bc1-2 mRNA表达。结果：B组关节软骨呈典型OA形态学改变，关节软骨细胞中Bc1-2 m RNA表达减弱；C、D组关节软骨轻度退变，形态学方面与A组接近，关节软骨细胞中Bc1-2 m RNA表达显著增强，与B组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：痹痛合剂与硫酸氨基葡萄糖能延缓OA大鼠关节软骨的退变，其可能的作用机制是通过提高关节软骨细胞中Bc1-2基因的表达，抑制关节软骨细胞的凋亡。

骨性关节炎；软骨细胞；细胞形态学；B细胞淋巴瘤/白血病-2；痹痛合剂

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是中老年人常见病、多发病，已成为影响老年人运动及致残的重要原因之一。其主要的病理特征为关节软骨形态发生变化（退变）。关节疼痛是其主要的临床表现。因此，既能止痛又能延缓关节软骨退变的药物是较为理想的选择。痹痛合剂是院内制剂，临床应用治疗骨性关节炎几十年，能有效缓解膝骨性关节炎患者的疼痛［1］。但能否有效缓解或阻止病情发展有待进一步研究。本实验通过建立OA大鼠模型，观察痹痛合剂对骨性关节炎软骨细胞形态学变化的影响并探讨其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验设计随机对照动物实验。

1.2实验动物SD雄性大鼠64只，体质量200～220 g，2月龄，购于常州卡文斯实验动物有限公司；南京中医药大学动物试验中心鼠类实验室提供SPF级医学实验动物环境设施，动物许可证号：SYXK（苏）2012-0042。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

1.3试剂及仪器痹痛合剂（南京市中医院院内制剂，苏药制字Z04000864）；硫酸氨基葡萄糖胶囊（浙江海正药业股份有限公司生产，国药准字H20041316）；磷酸盐缓冲液（PBS）；Bc1-2预杂交液和杂交液，Bc1-2原位杂交检测试剂盒及探针（南京建成生物工程公司）；流式细胞仪（贝克曼库特FC500）；全自动化学发光凝胶成像分析系统（Chemi Doc XRS+）；荧光显微镜（奥林巴斯BX43）；研究型倒置荧光显微镜（徕卡DMI3000B）；恒温箱（Thermo HRRAce11 150i）；扫描式电镜（日本JSM-6010LA）。

1.4实验方法

1.4.1分组将64只大鼠按随机数字表法分为假手术组（A组）、模型组（B组）、硫酸氨基葡萄糖组（C组）和痹痛合剂组（D组），每组16只。

1.4.2动物模型的建立A组皮肤切开后，随即缝合，不作其他处理；B、C、D组用硫喷妥钠从耳静脉麻醉，固定，常规备皮消毒，沿髌骨韧带内侧缘切口，切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部，并在断端处修剪去除约2 mm，造成双后肢膝外翻畸形，逐层缝合伤口，无菌敷料及绷带包扎固定，术后连续3天肌肉注射青霉素2万U预防感染。术后1周将造模大鼠置于拖箱内，每天赶其行走30分钟，16周后X线检查，关节边缘变尖锐，并逐渐发展成为骨赘者证实造模成功。

1.4.3给药A组予正常水和饲料喂养，B组生理盐水灌胃（3次/d，3 mL/次），C组硫酸氨基葡萄糖溶液3 mL（含药0.037 68 g）灌胃，3次/d，D组痹痛合剂水溶液3mL（含药1.25 mL）灌胃，3次/d。灌服药物剂量按人与大鼠体表面积换算［2］。各组术后第2天开始给药，连续8周。

1.4.4关节软骨形态学大体观察每组随机抽取8只大鼠进行大体观察，停止给药后处死大鼠，立即将大鼠于仰卧位固定，取材部位消毒，切开膝关节囊，大体观察后股骨髁关节面病理改变按照以下标准评分：1）关节面光整、色泽如常为O分；2）关节面粗糙不平，有小的裂隙且色泽灰暗为1分；3）关节面糜烂，缺损深达软骨表中层为2分；4）关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层为3分；5）软骨剥脱，软骨下骨质暴露为4分。

1.4.5关节软骨细胞的形态学观察同“1.4.4”项方法，取材部位消毒，用锐利刀片切取股骨内髁软骨，做成2 mm×1 mm全层软骨标本，2.5%戊二醛溶液固定，HE染色，光镜400×和电镜下观察。

1.4.6原位杂交法检测关节软骨细胞中bc1-2 m RN A表达同“1.4.4”项，剩下的股骨内髁软骨连同胫骨平台关节面一并切下，立即用PBS洗净，用新鲜配制的4%多聚甲醛0.1m（含有1/1000DEPC）固定过夜。10%EDTA（含1/1000DEPC）脱钙10天，石蜡包埋，切片。原位杂交：切片脱蜡至水；3%H2O2室温处理10分钟以灭活内源性过氧化物酶；3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化5分钟；滴加20 μL预杂交液至bc1-2原位杂交检测试剂盒中。放入恒温箱37℃20分钟；滴加20 μL杂交液，恒温箱37℃杂交过夜（12小时）；滴加封闭液37℃30分钟；滴加生物素过氧化酶37℃20分钟；滴加DAB，显色10分钟。自来水冲洗10分钟；苏木素复染1秒，充分水洗；乙醇脱水，二甲苯透明封片。标本切片置于光镜下（×400），将图像输入图像处理系统，每张切片选择10个不同视野，对软骨细胞中bc1-2mRNA阳性表达用阳性面积和灰度值进行量化（灰度值系统设定白色最大灰度为255，黑色最小灰度为0。灰度值越小，说明其阳性反应程度越高，表达越强，反之则表达越弱）。

1.4.7阳性结果判断以细胞质及细胞核内出现棕黄色着色者为阳性，未加探针者为阴性对照。

1.5主要观察指标观察各组大鼠关节软骨细胞形态学变化及关节软骨细胞bc1-2基因表达水平的变化。

1.6统计学方法数据采用SPSS 21.0统计学软件完成，以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较用SNK-q检验，等级资料采用Ridit分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1大体观察A组胫骨平台及股骨外侧髁关节面光滑平整清楚，有光泽，关节软骨完好；B组胫骨平台及股骨外侧髁关节面不平整模糊不清，关节软骨层无光泽、颜色灰暗，关节软骨损坏严重，关节边缘及关节内均可见有骨赘形成，外髁负重区见软骨剥脱；C、D组关节面大体形态基本相同，关节面清楚，光滑平整，有光泽，关节软骨基本完好，外髁负重区软骨基本完好，关节边缘无骨赘形成，见表1。

2.2光镜下H E染色大鼠关节软骨细胞形态学表现A组：软骨表面光滑，软骨细胞排列整齐，且四层结构清晰可辨，潮线完整，软骨基质染色为粉红色，着色均匀；B组：关节软骨破坏最为严重，软骨表面粗糙糜烂不整，形成缺损区；C组：细胞四层结构基本清晰，潮线基本完整，有少许软骨细胞存在轻度变性；D组：细胞四层结构基本清晰，潮线基本完整，关节软骨有少许炎性细胞侵润，关节软骨细胞有轻度变性，见图1。

表1　各组大鼠股骨髁关节面病理改变评分分布

图1　光镜下各组大鼠关节软骨细胞形态学表现（H E 400×）

2.3电镜下观察软骨细胞的形态学变化A组：膝关节内髁部软骨细胞分布均匀，细胞壁连续，细胞核饱满，线粒体及内质网排列整齐无扩张肿胀，染色体分布均匀，胶质纤维连续性好，排列密集而整齐，有完整的结构。B组：膝关节内髁部软骨细胞分布不均匀，软骨细胞增多，主要表现为细胞核形态不规则且细胞壁破裂不整齐，细胞核缩小，染色体分布不均匀，胞质内可见线粒体肿胀、粗面内质网扩张，胞浆内微丝堆积，胶质纤维断裂，排列紊乱，见大量软骨细胞凋亡。C组：膝关节內髁部软骨细胞分布较均匀，细胞壁连续，细胞核饱满，线粒体及内质网排列整齐，染色体分布均匀，胶质纤维连续排列密集整齐，偶见部分软骨细胞凋亡。D组：膝关节内髁软骨细胞分布均匀，细胞壁连续，细胞核饱满，线粒体及内质网排列整齐，染色体分布均匀，胶质纤维连续排列密集整齐，有完整的纵横向结构，有少量软骨细胞凋亡，见图2。

图2　电镜下各组大鼠关节软骨细胞形态学变化

2.4原位杂交法检测关节软骨细胞中Bc1-2 m RN A表达4组均检测到bc1-2 mRNA的表达，其中A组表达较强，B组表达明显减弱；D、C组干预后关节软骨细胞中Bc1-2 mRNA阳性细胞的表达明显升高，接近正常组（P＞0.05），与B组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。C组与D组无明显差异（P＞0.05），见图3，表2。

图3　光镜下各组大鼠关节软骨细胞Bc1-2 m RN A表达（400×）

表2　原位杂交法检测关节软骨细胞中bc1-2 m RN A阳性表达灰度值

3　讨论

骨性关节炎又称退行性骨关节炎，关节软骨细胞变性、结构破坏、细胞凋亡甚至软骨缺损等形态学的变化是其基本的病理改变［3-6］。由于没有神经、血管和淋巴的分布，软骨虽然有一定的自我修复能力，但是大于5 mm以上的局部软骨损伤很难自我修复，关节炎类软骨疾病一直不能得到很好的治疗［7-8］。目前临床上治疗骨性关节炎的药物主要有两大类：1）消炎止痛类，如非甾体抗炎药、选择性COX-2抑制剂等，能有效缓解疼痛，但长期服用可使关节软骨蛋白多糖和透明质酸的合成减少，加重骨性关节炎的病理损害［9］。2）缓解病情类，如氨基葡萄糖，它是一种糖胺聚糖，以乙酰化的形式存在于关节软骨，椎间盘和滑液中，是一种天然的蛋白多糖［10］，目前广泛应用于临床治疗骨性关节炎［11-12］。其能特异性地作用于关节软骨，维护软骨基质的形态结构，还能抑制前列腺素的合成，保护各种有害物质对软骨细胞的破坏，改善关节活动，缓解疼痛，延缓骨性关节炎退变的过程［13-14］。但临床应用发现其止痛作用有限。因此寻找一种既能有效止痛，又能延缓疾病发展的药物具有重大意义。中医药注重整体观，采用辨证论治的方法从中医药宝库中挖掘，有望实现该目的。由于OA疾病涉及较多蛋白质，通过蛋白质组学技术发现并鉴定的骨性关节炎相关蛋白已有100多个［15-16］。中药多靶点调节（从疾病整体水平上的调节）相对于西医单一化合物单一靶点的治疗模式有较大的优势［17］。痹痛合剂在我院用于治疗骨性关节炎已有几十年，临床研究表明能有效缓解骨性关节炎患者疼痛等临床症状，改善关节功能，总有效率高于硫酸氨基葡萄糖［2］；实验研究表明，痹痛合剂能够抑制关节液中细胞因子IL-1、TNF-α表达［18］，推测痹痛合剂能够保护关节软骨，延缓骨性关节炎的发展，但缺乏直接的证据。本研究通过对OA大鼠关节软骨形态学研究发现，OA大鼠关节软骨发生明显退变，模型组呈现典型骨性关节炎关节软骨形态学变化，病理改变评分与正常组比较明显增高（P＜0.01）。给予痹痛合剂和硫酸氨基葡萄糖干预后无论是大体观察还是镜下观察，关节软骨的退变均有明显改善，与模型组比较关节软骨病理改变评分下降明显（P＜0.01），表明痹痛合剂能够有效保护软骨，延缓关节软骨的退变。

中医认为，OA发病是肝肾亏虚为本，合风寒湿邪入侵所形成的痹痿兼症，其中有着复杂的机理和各种因素相互作用，以肝肾亏虚为基础，此外还有脾虚、血瘀、痰湿几个重要环节［19-22］。痹痛合剂正是基于以上理论，经过几代人的努力，研制而成。方中怀牛膝、续断、狗脊、香加皮为君药，以补肝肾、强筋骨，其中怀牛膝为引经药；独活、防风祛下焦与筋骨间风寒湿邪，威灵仙、徐长卿舒筋通络止痹痛；鸡血藤、桂枝、地鳖虫活血通络，通达四肢关节；川乌（制）、草乌（制）散寒止痛；白术、炒薏苡仁、陈皮、茯苓行气化痰，健脾祛湿；虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过，诸药合用共奏补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功。综观全方，扶正祛邪、标本兼顾，可使肝肾强、筋骨壮，风湿除而痹痛愈。但其作用机制目前尚不清楚。研究认为细胞凋亡在骨性关节炎的病理过程中起着重要作用［23］。Bc1-2基因是一种原位癌基因，参与细胞凋亡的调控，它通过抑制线粒体释放cytc来抑制细胞的凋亡［24］。学者研究发现［25］，老年个体Bc1-2表达较正常人低；小鼠在剔除Bc1-2基因后表现出典型中医肾虚症状：发育不良、形体小、寿命缩短、毛发色泽变浅、软骨发育异常、多囊肾和生殖能力下降等［26-27］。因此，有学者认为，Bc1-2基因家族在体内作用与中医肾的功能非常接近，并提出［28］“Bc1-2家族可能是中医肾本质相关基因”的假说。因此，补肾疗法有可能提高Bc1-2基因的表达。本研究结果表明，正常组关节软骨Bc1-2基因表达最强，模型组表达减弱（P＜0.01），痹痛合剂和硫酸氨基葡萄糖干预后其表达增强（与模型组比较P＜0.01），因而，痹痛和剂和硫酸氨基葡萄糖均能提高OA大鼠关节软骨细胞中Bc1-2基因的表达。

综上所述，痹痛合剂能有效延缓OA大鼠关节软骨细胞的退变，延缓OA病情的发展，其可能的作用机制是通过提高关节软骨细胞中Bc1-2基因的表达，抑制关节软骨细胞的凋亡而起作用。其具体的作用靶点有待进一步深入研究。

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The Influence of BiTong Mixture on the Expression of Cartilage Cells Bcl-2 and Articular Cartilage Morphological Changes of OA Rats

LI Suming，HANG Baiya△
Nanjing Municipality TCM Hospital，Nanjing 210001，China

Objective:To observe the influence of BiTong mixture on articular cartilage morphology of osteoarthritis（OA）rats，and explore its possible mechanism.Methods:Sixty-four SD male rats were randomized into sham operation group（A），the model group（B），glucosamine sulfate group（C）and BiTong mixture group（D），the rats in group A were performed with sham operation，the rats in the group B，C and D were replicated by Hulth method，the rats in the group A accepted conventional feeding，the rats in other groups took physiological saline，glucosamine sulfate solution and BiTong mixture after the operation respectively.The rats were sacrificed at the eighth week after the operation，cellular morphology of articular cartilage was inspected by gross observation，under light microscope and electron microscope，and the expressions of Bcl-2 mRNA in articular cartilage cells were detected by in situ hybridization（ISH）.Results:Articular cartilage showed typical OA morphological changes in the group B，the expressions of Bcl-2 mRNA in articular cartilage cells reduced obviously；articular cartilage degenerated slightly in the groups C and D，morphological changes were similar to the rats in the group A，the expressions of Bcl-2 mR -NA in articular cartilage cells enhanced significantly，it had significant difference compared with the group B（P＜0.01）. Conclusion:BiTong mixture and glucosamine sulfate solution could delay articular cartilage degeneration of OA rats，and the mechanism might be inhibiting articular cartilage cellular apoptosis by raising the expressions of Bcl-2 mRNA in articular cartilage cells.

osteoarthritis；cartilage cells；cellular morphology；B cell lymphoma/leukemia-2；BiTong mixture

R285.5

A

1004-6852（2016）05-0018-05

2015-05-10

南京市医学科技发展项目（编号YKK 12151）。

李素明（1975—），男，硕士学位，副主任医师，副教授。研究方向：骨与关节疾病的中西医结合治疗。

杭柏亚（1965—），男，硕士研究生导师，主任医师。研究方向：骨关节疾病的中西医结合治疗。