芍药苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响及其作用机制

刘天易

山东中医药大学附属医院药学部，山东济南250000

芍药苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响及其作用机制

刘天易

山东中医药大学附属医院药学部，山东济南250000

目的：探讨芍药苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：选择健康雄性SD大鼠80只，随机分为假手术组、模型组、芍药苷组及尼莫地平组各20只，建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察各组大鼠神经行为学评分及脑梗死面积，TU N EL检测大鼠神经细胞凋亡情况，免疫组化法检测大鼠大脑皮层中Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果：假手术组大鼠未表现出神经功能缺失症状，模型组大鼠神经行为学评分及脑梗死面积高于假手术组，芍药苷组及尼莫地平组均低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；假手术组几乎未见神经细胞凋亡，模型组TU N EL阳性细胞明显多于假手术组，芍药苷组及尼莫地平组细胞凋亡个数及阳性率均低于模型组，其差异具有统计学意义（P＜0.05）；假手术组大鼠大脑皮质中Bcl-2及Bax的灰度值均高于模型组，芍药苷组及尼莫地平组大鼠Bcl-2灰度值较模型组降低，而Bax灰度值较模型组明显升高，2组Bcl-2/Bax灰度值较模型组下降，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：芍药苷可通过抑制Bax的表达，上调Bcl-2的表达来抑制神经细胞凋亡，从而保护神经功能，减轻脑梗死。

脑缺血再灌注；细胞凋亡；芍药苷

近年来，有研究表明［1-2］，脑缺血再灌注对梗死区脑组织造成严重损伤，细胞凋亡在其损伤病理过程中起重要作用，尤其是迟发性神经元死亡。细胞凋亡是缺血半暗带内细胞死亡的主要途径，可造成梗死灶的形成及扩大。因此，减少缺血半暗带神经元凋亡，成为治疗缺血性脑血管病的主要治疗方向。芍药苷（Peonif1orin，PF）为单萜糖苷类化合物，是一种毛茛科植物芍药根中的生物活性成分，具有清热凉血、散瘀止痛的作用［3］。本研究主要探讨芍药苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响及其主要作用机制，为临床缺血性脑血管疾病的治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1动物健康雄性SD大鼠80只，体质量250～300 g，平均（280.5±15.9）g，由山东中医药大学附属医院实验动物中心提供，实验动物合格证号：ab120836。

1.2药物、试剂与仪器芍药苷粉剂（南京青泽药业有限公司生产，批号：110736-201435）；尼莫地平注射液（上海信谊金珠药业有限公司生产，批号：H20000682）；TUNEL试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司生产，批号：11684817910）；Bc1-2兔抗鼠多克隆抗体和Bax兔抗鼠多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司生产）；TGL-16G型低温冷冻离心机（日本日立公司生产）；722s分光光度计（上海第三分析仪器厂生产）。

1.3方法将80只大鼠随机分为假手术组、模型组、芍药苷组及尼莫地平组，每组20只。所有大鼠均于术前30分钟腹腔注射药物，芍药苷组给予芍药苷60 mg/kg；尼莫地平组给予尼莫地平0.4 mg/kg；假手术组及模型组大鼠均予等量生理盐水。

1.4模型建立大鼠脑缺血再灌注模型建立使用改良Longa线栓法：首先使用10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉，将左侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉钝性分离后，对颈外动脉进行结扎处理，用动脉夹将颈内动脉远心端夹闭，并于颈总动脉远端剪一切口，将头端钝化的直径0.234 mm的鱼线沿颈总和颈内动脉缓慢插入，松开动脉夹，阻塞大脑中动脉，固定栓线并缝合切口。将所有模型大鼠放回笼内并给予食物和水，同时保持体温在37℃左右，24小时后拔线，再灌注24小时。假手术组大鼠只进行左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉的分离，不阻塞大脑中动脉，其余步骤与模型大鼠相同。大鼠模型建立成功标准：动物清醒后，出现上眼睑下垂、瞳孔散大，爬行时向右侧倾斜或顺时针旋转，提尾时大鼠右前肢内收屈曲等表现，同时大鼠存活达24小时。

1.5神经行为学评分大鼠麻醉清醒后，依据Longa等方法对其神经功能缺损情况进行评分。1）0分，正常活动，无神经功能缺失症状；2）1分，提尾时病灶对侧前肢部能完全伸直；3）2分，爬行时表现为向对侧转圈；4）3分，行走时表现为身体向对侧倾倒；5）4分，不能自主行走，意识丧失。得分越高，表明动物的行为障碍越严重。

1.6指标检测TUNEL检测细胞凋亡：大鼠再灌注24小时后，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，每组各取8只大鼠经左心室灌流生理盐水，冲出血液，并用4%多聚甲醛灌流固定，固定完成后立即断头取脑，将脑组织放入4%多聚甲醛中固定，常规脱水并使用石蜡包埋，自视交叉前缘向后连续冠状位切片，片厚4 μm，取相同层面石蜡切片4张，严格按照试剂盒说明进行TUNEL检测细胞凋亡，凋亡的神经细胞核表现为固缩、浓染的棕褐色颗粒，多见于梗死灶周围的脑组织。Bc1-2和Bax蛋白表达：取上述石蜡切片，采用免疫组化法进行检测，400倍光学显微镜下观察，细胞胞质呈棕黄色即为阳性细胞。采用CIAS-1000型图像分析仪测量每组平均灰度值，平均灰度值越低，表明切片免疫组化染色越深，蛋白阳性表达越强。

1.7统计学方法应用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠神经行为学评分假手术组大鼠未表现出神经功能缺失症状，模型组神经行为学评分明显高于假手术组，芍药苷组及尼莫地平组明显低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；模型组脑梗死面积高于假手术组，芍药苷组及尼莫地平组低于模型组，其但差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2大鼠神经细胞凋亡情况假手术组几乎未见神经细胞凋亡，模型组TUNEL阳性细胞明显多于假手术组，芍药苷组及尼莫地平组细胞凋亡个数及阳性率明显低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3大鼠大脑皮层Bcl-2及Bax蛋白的表达情况假手术组大鼠大脑皮质中Bc1-2及Bax的灰度值均高于模型组，即蛋白的表达较低，芍药苷组及尼莫地平组大鼠Bc1-2灰度值较模型组降低，而Bax灰度值较模型组升高，即Bc1-2蛋白的表达增加而Bax蛋白的表达降低，2组Bc1-2/Bax灰度值较模型组下降，其差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表1　大鼠神经行为学评分（±s）

表1　大鼠神经行为学评分（±s）

注：△表示与假手术组比较，P＜0.05；▲表示与模型组比较，P＜0.05。

组别只数剂量/（m g·kg-1）神经行为学评分/分脑梗死面积/%假手术组20-00模型组20-3.1±0.5△0.5±0.1△芍药苷组20602.5±0.4▲0.4±0.1尼莫地平组200.42.3±0.5▲0.4±0.1

表2　大鼠神经细胞凋亡情况比较（±s）

表2　大鼠神经细胞凋亡情况比较（±s）

注：△表示与假手术组比较，P＜0.05；▲表示与模型组比较，▲P＜0.05。

组别只数剂量/（m g·kg-1）细胞凋亡个数/个阳性率/%假手术组8-00模型组8-12.0±1.8△66.2±7.3△芍药苷组8607.2±1.9▲42.0±8.4▲尼莫地平组80.47.7±1.9▲43.1±7.6▲

表3　大鼠大脑皮层Bcl-2及Bax的灰度值（±s）

表3　大鼠大脑皮层Bcl-2及Bax的灰度值（±s）

注：△表示与假手术组比较，P＜0.05；▲表示与模型组比较，P＜0.05。

组别只数剂量/（m g·kg-1）Bcl-2/kD aBax/kD aBcl-2/Bax假手术组8-172.4±6.8173.0±7.30.9±0.1模型组8-161.4±5.2△140.0±5.2△1.2±0.1△芍药苷组860123.1±5.5▲159.8±5.9▲0.8±0.1▲尼莫地平组80.4122.0±5.9▲161.2±6.2▲0.7±0.1▲

3　讨论

有研究认为［4］，脑缺血再灌注损伤产生的主要原因为神经细胞凋亡，其主要通过诱导神经元的凋亡，对Caspase家族、Bc1-2家族、P38MAPK、Fas/Fas1等基因的表达进行调节，造成脑缺血损伤，尤其在缺血半暗带区，细胞凋亡成为神经细胞死亡的主要方式［5］。本研究发现，假手术组大鼠未表现出神经功能缺失症状，模型组神经行为学评分高于假手术组，且模型组大鼠脑梗死面积明显高于假手术组，另外，假手术组几乎未见神经细胞凋亡，模型组TUNEL阳性细胞多于假手术组，表明脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡情况明显增多。

目前，中医学认为缺血性脑血管病属“中风”范畴，其主要病机特点为本虚标实［6］，有研究认为［7］，肾虚为该病之本，风痰瘀热毒为该病之标，病位在脑之脉络，因此，中药治疗手段应以补肾益气活血为主，使肾精得复，脑髓得充，脑络得养。研究发现［8］芍药苷具有抗自由基损伤，抑制细胞内钙超载以及抗神经毒性等活性，可明显降低机体血液黏度，扩张血管，改善微循环等，改善肾功能。另外，近年国内外研究发现芍药苷对神经具有保护作用［9-10］。本研究发现，使用芍药苷治疗的大鼠，其神经行为学评分低于模型组，而且脑梗死面积小于模型组，同时其神经细胞凋亡个数及阳性率均较模型组明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明芍药苷所具有的补肾益气功效在一定程度上可减少大鼠神经细胞凋亡，保护神经功能。有研究报道［11］，Bc1-2家族主要包括抗凋亡基因（Bc1-2、Bc1-x1等）和促凋亡基因（Bad、Bax等）两大类，其中Bc1-2和Bax是调节神经细胞凋亡的两个重要相关基因，在脑缺血再灌注损伤过程中，Bc1-2过表达可有效抑制细胞凋亡，当抑制Bc1-2基因表达或敲除时可加速缺血神经细胞的死亡；而Bax过表达可抑制Bc1-2基因表达从而促使细胞凋亡，因此，Bc1-2/Bax比值同样是决定细胞凋亡的关键，当比值增大时，细胞凋亡受抑制，反之则促进细胞凋亡，一般在正常大鼠脑组织中Bc1-2和Bax表达均较少，当出现脑缺血再灌注时，两种基因表达水平均明显升高［12］。本研究中模型组大鼠Bc1-2和Bax蛋白的表达水平较假手术组升高，芍药苷组及尼莫地平组大鼠Bc1-2灰度值较模型组降低，而Bax灰度值较模型组升高，即Bc1-2蛋白的表达增加而Bax蛋白的表达降低，2组Bc1-2/Bax灰度值较模型组下降，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示芍药苷可能通过调节Bc1-2和Bax蛋白的表达，从而减少神经细胞凋亡，减轻脑梗死。

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The Effects of Peoniflorin on Cellular Apoptosis of the Rats with Cerebral I shchemia R eperfusion Injury and Its Mechanism

LIU Tianyi
Pharmaceutical Department of Affiliated Hospital to Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250000，China

Objective:To investigate the effects of peoniflorin on cellular apoptosis of the rats with cerebral ischemia reperfusion injury and its mechanism.Methods:Eighty SD rats were randomized into sham operation group，the model group，peoniflorin group and nimodipine group，20 cases in each group，the rat model with cerebral ischemia reperfusion injury was established，neurological behavior score and infarct area of the rats in different groups were observed，neural cell apoptosis of the rats were detected by TUNEL，the expressions of Bcl-2 and Bax protein were measured by immunohistochemical method.Results:The rats in the sham operation group didn't manifest the symptoms of nerve function impairment，the model group was higher than the sham operation group in neurological behavior score and infarct area obviously，peoniflorin group and nimodipine group were lower than the model group notably，and the difference showed statistical meaning（P＜0.05）；no nerve cellular apoptosis had been seen in the sham operation group，the model group was more than the sham operation group in TUNEL positive cells，peoniflorin group and nimodipine group were lower than the model group in the numbers of apoptotic cells and positive rates significantly，and the difference showed statistical meaning（P＜0.05）；gray levels of Bcl-2 and Bax in the sham operation group were higher than these of the model group，gray level of Bcl-2 decreased in peoniflorin group and nimodipine group compared with the model group，while Bax gray level raised obviously in both groups compared with the model group，and the difference demonstrated statistical meaning（P＜0.05）.Conclusion:Peoniflorin could inhibit the apoptosis of nerve cells by inhibiting the expressions of Bax and up regulating Bcl-2 expressions，thereby to protect nerve function and alleviate cerebral infarction.

cerebral ischemia reperfusion；cellular apoptosis；peoniflorin

R285.5

A

1004-6852（2016）05-0008-04

2015-02-23

刘天易（1983—），男，硕士学位，主管药师。研究方向：中药学及中药药理学。