microRNA-7敲减对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响①

赵娟娟　徐华林　郭萌萌　陶弋婧　周　涯　陈　超　秦娜琳　郑　静　田　丹　徐　林

(遵义医学院免疫学教研室暨贵州省生物治疗人才基地，遵义563000)



microRNA-7敲减对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响①

赵娟娟徐华林郭萌萌陶弋婧周涯②陈超秦娜琳郑静田丹徐林

(遵义医学院免疫学教研室暨贵州省生物治疗人才基地，遵义563000)

目的：观察microRNA-7(miR-7)敲减对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响并探讨其意义。方法：利用脂多糖(LPS)腹腔注射(10 mg/kg体重)野生型(Wild type，WT)小鼠和miR-7基因敲减(Knockdown，KD)小鼠建立急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)模型；HE染色观察肺组织病理学变化；计算肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数；Real-time PCR检测肺组织炎症相关因子表达变化；流式细胞术(FACS)进一步检测BAL中固有免疫细胞γδ T细胞、F4/80巨噬细胞(Macrophages，Mφ)和适应性免疫细胞CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例和绝对数变化；FACS检测CD4+T细胞活化相关分子CD62L和CD69的表达水平。结果：相对野生型(Wild type，WT)小鼠，HE染色显示miR-7KD小鼠的肺组织小血管充血和炎性细胞浸润明显减少，病理性损伤明显减轻；Real-time PCR结果显示促炎性细胞因子IL-6的表达水平显著降低(P<0.01)，而抗炎性细胞因子IL-4、TGF-β的表达水平明显增加(P<0.05)；同时，BAL中总细胞数显著减少(P<0.05)；FACS检测进一步显示miR-7KD小鼠的BAL中F4/80+Mφ细胞的比例及绝对数均明显下调(P<0.05)，而γδ T细胞的比例上调(P<0.05)，但其细胞绝对数无差异(P>0.05)；BAL中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例及其绝对数均显著降低(P<0.05)；最后CD4+T细胞活化膜分子CD62L的表达水平明显上调(P<0.05)，而CD69的表达水平显著下调(P<0.05)。结论：miR-7敲减可减轻ALI模型小鼠的肺部损伤，提示其可能在ALI发生中发挥了重要调控作用。

miR-7基因敲减；急性肺损伤；肺泡灌洗液；免疫细胞

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是以肺部严重的急性炎症性反应为特征的常见疾病[1-3]，其发生发展过程十分复杂，涉及到多种免疫细胞和免疫分子的参与。近来研究显示微小RNA(microRNA，miRNA)在ALI的发生发展中起着重要调控作用。miR-7作为miRNA家族成员之一，新近被报道与多种临床疾病的发生密切相关[4-6]。然而，miR-7在ALI发生中的可能作用及相关机制仍未有研究报道。因此，本研究拟利用前期构建成功的miR-7基因敲减(Knockdown，KD)小鼠[7]，以LPS为致敏原常规建立ALI模型，初步观察miR-7敲减后对小鼠肺组织损伤的影响，并初步探讨其意义，以期为后续深入探讨miR-7在ALI发生中的作用提供前期实验基础。

1　材料与方法

1.1材料8周FVB背景的SPF级雌性野生型小鼠和miR-7KD小鼠[7]；显微镜(Olympus)；流式细胞仪(Beckman Coulter)；LPS(Sigma)；SYBRPremix Ex Taq Ⅱ (2×) (TAKARA.RR820A)；10%水合氯醛(遵医附院研制)；R-Phycoerythrin(PE)标记的CD4、CD62L抗鼠的单克隆抗体，Percp-Cy5.5标记的CD4、F4/80抗鼠单克隆抗体，Allophycocyain(APC)标记的CD8、CD69、γδT细胞抗鼠单克隆抗体，PE-Cy7标记的CD8细胞抗鼠单克隆抗体，Fixation/Permeabilization Diluent(Ebioscience)；血细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1 以LPS为致敏原建立ALI模型按照每只小鼠每千克体重10 mg LPS的剂量，进行腹腔注射，48 h后，观察两组小鼠肺组织炎性损伤的情况。

1.2.2HE染色观察肺脏组织的病理学改变取miR-7KD小鼠和WT小鼠肺脏组织，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，然后用石蜡包埋，制成5 μm切片并做HE染色，最后在倒置显微镜下观察肺脏组织的病理学变化。

1.2.3利用Real-time PCR手段检测肺组织中炎性因子的表达水平提取ALI模型下，WT和miR-7 KD小鼠的肺组织的RNA，逆转为cDNA，进行实时定量Real-time PCR检测。Real-time PCR检测体系为20 μl，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(×2) 10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物混合液(1 μmol/L)1 μl，高压的去离子水7 μl。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45个循环。每个反应设置3复孔，复孔间Cq值差异不超过0.5者用于数据分析。

1.2.4获取小鼠的肺泡灌洗液并记取所含细胞的总数首先以5%水合氯醛(10%水合氯醛加PBS配置而成)，按照0.005 ml/g小鼠体重经行腹腔注射，2 min后小鼠进入麻醉状态；接着将麻醉状态中的小鼠置于手术板上，固定四肢。用剪刀、镊子对小鼠的颈部经行解剖，暴露出气管，用穿刺针进行插管，所有小鼠均用0.8 ml的PBS进行2次灌洗，收集灌洗液入2 ml离心管中，4℃ 1 500 r/min离心15 min，小心弃去上清，用1 ml PBS重悬细胞沉淀，取10 μl重悬液进行细胞计数。将剩余液体再次4℃离心，待流式细胞术(FACS)的检测。

1.2.5FACS检测BAL中F4/80巨噬细胞、γδT细胞以及T淋巴细胞亚群及相关膜分子表达的比例变化将1.2.4中获得的miR-7KD小鼠和WT小鼠BAL中的细胞，经PBS 1 200 r/min离心10 min洗涤2次后，弃掉上清液，在余下细胞沉淀中加入200 μl PBS，然后弹散，经筛网过滤后分别加入PE标记的CD4、CD62L荧光抗体，Percp-Cy5.5标记F4/80、CD4、CD8荧光抗体，APC标记的γδT、CD8、CD69荧光抗体各1 μl，冰上避光孵育30 min，PBS洗涤2遍，最后通过FACS进行检测。

1.3统计学分析本实验中对细胞因子表达水平的分析采用2-ΔΔCt法进行。反应体系中荧光信号达到阈值的循环数为Ct，ΔΔCt=(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参基因)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因)，计算ΔΔCt后再计算2-ΔΔCt值，2-ΔΔCt为该基因的相对表达量。

2　结果

2.1 HE染色观察肺组织的病理学改变HE染色结果显示，与WT小鼠相比，miR-7KD小鼠的肺间质中血管充血明显减轻，且炎性细胞浸润显著减少(图1)。

2.2 肺组织中炎性因子IL-6、IL-4和TGF-β的表达水平Real-time PCR检测结果显示，miR-7KD小鼠的肺组织中促炎性细胞因子IL-6的表达水平显著降低(图2C，P<0.01)。抗炎性细胞因子IL-4，TGF-β的表达水平明显增高(图2C，P<0.01)。

2.3 ALI模型下miR-7KD小鼠的BAL细胞总数变化结果显示miR-7KD小鼠的BAL中总细胞数明显低于WT小鼠BAL中总细胞数(图3，P<0.01)。

2.4 BAL中γδT细胞、F4/80+Mφ细胞的比例和绝对数变化如图4A、B所示，与WT小鼠相比，miR-7KD小鼠BAL中F4/80+Mφ细胞的比例显著下调(P<0.05)、而γδT细胞的比例却明显上调(P<0.05)；进一步统计分析BAL中F4/80+Mφ细胞和γδT细胞的绝对数，结果显示，F4/80+Mφ细胞的绝对数显著减少(图4C，P<0.01)，而γδT细胞的绝对数则无明显差异(P>0.05)。

图1　ALI模型下的WT小鼠和miR-7KD小鼠的肺脏组织病理学变化(HE染色)Fig.1　Lung pathology of LPS treated-miR-7KD mice and WT mice(HE staining)

图2　ALI模型下miR-7KD小鼠肺组织中炎性因子表达变化Fig.2　Relative expression of cytokines in lung of LPS treated-miR-7KD miceNote: A.Amplification curves；B.Melt peak；C.Relative expression level of cytokine including IL-6,IL-4,TGF-β；*.P<0.05,**.P<0.01 compared with WT mice.

2.5BAL中CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例和绝对数变化结果显示，miR-7KD小鼠BAL中的 CD4+T细胞和CD8+T细胞比例均较WT小鼠BAL中显著下调(图5A、B，P<0.05)；与此同时，BAL中的 CD4+T细胞和CD8+T细胞的绝对细胞数也均明显减少(图5C，P<0.05)。

2.6BAL中CD4+T细胞中CD62L、CD69的表达变化结果显示，与WT小鼠组相比，miR-7KD小鼠BAL中CD4+T细胞的CD69+细胞的比例和绝对数均明显减少(图6，P<0.05)；而CD62L+细胞的比例增加(P<0.05)，而绝对数仍显著减少(图6，P<0.05)。

图3　ALI模型下miR-7KD小鼠BAL中总细胞数的变化Fig.3　Change of total cell counts of BAL in LPS-treated miR-7KD miceNote: *.P<0.01.

图4　ALI模型下miR-7KD小鼠BAL中γδT细胞、F4/80巨噬细胞的比例和绝对数变化Fig.4　Change on proportion and cell counts of γδT and F4/80+Macrophages(Mφ) cells in BAL of LPS-treated miR-7KD miceNote: A.FACS analysis;B.The percentage;C.Cell counts;*.P<0.05,**.P<0.01 compared with WT mice.

图5　ALI模型下miR-7KD小鼠BAL中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的比例和绝对数变化Fig.5　Change on proportion and cell counts of CD4+ T cells and CD8+ T cells in BAL of LPS-treated miR-7KDNote: A.FACS analysis;B.The percentage;C.Cell counts;*.P<0.05,**.P<0.01 compared with WT mice.

图6　ALI模型下miR-7KD小鼠BAL中CD4+T细胞中CD62L+细胞和CD69+细胞的比例和绝对数变化Fig.6　Change on proportion and cell counts of CD4+CD62L+ T cells and CD4+CD69+ T cells in BAL of LPS-treated miR-7KDNote: A.The percentage;B.Cell counts;*.P<0.05,**.P<0.01 compared with WT mice.

3　讨论

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一大类由内源性基因编码、成熟体长度约在20～25个核苷酸序列的非编码短小单链RNA，主要通过作用靶基因的3′非编码端参与真核基因的转录后水平的调节。已有大量研究数据表明，miRNAs分子在ALI的发生中发挥了重要作用。如Xie等[8]研究发现miR-127可通过下调M1巨噬细胞极化的重要分子CD64的水平，从而减少M1巨噬细胞的功能来减弱ALI的病理性损伤；Yang等[9]的实验数据也表明高水平的miR-320可通过下调沉默调节蛋白1(Sirtuin type 1，SIRT1)引起肺泡上皮的损伤，易于诱发ALI；新近，我们也发现miR-155的反义寡核苷酸(miR-155ASO)可以通过增加M2型Mφ细胞分泌IL-10的水平，上调的IL-10随后又可调节CD4+CD25+regulatory T (Tregs)细胞的扩增，从而加快ALI损伤的恢复[10]。因此，深入探讨特定miRNA分子在ALI发生中的作用及相关机制不仅对于ALI发生机理的认识，且对于后续临床诊治均具有积极意义。

miR-7作为miRNA家族成员之一，在多个组织、器官及细胞中存在表达[11,12]，且与组织器官的发育、分化及损伤修复密切相关[13-15]。我们前期实验结果显示miR-7在肺组织高表达[11]。在本研究中，我们利用miR-7KD小鼠，首次以LPS为致敏原建立ALI模型，值得注意的是，经HE染色发现miR-7KD小鼠的肺组织炎性损伤明显减轻；同时，也发现BAL的细胞总数也显著减少。进一步Real-time PCR检测显示，miR-7KD小鼠肺组织中促炎性细胞因子IL-6的表达水平明显降低，而IL-4、TGF-β抗炎性细胞因子水平显著增加。以上数据均提示miR-7敲减后可减轻ALI模型的肺组织损伤。类似的，Rao等[16]发现miR-155可以通过对靶基因细胞因子信号抑制物1(Suppressor of cytokine signaling 1，Socs1)的抑制，增加肺组织炎性因子IFN-γ的分泌，使肺组织的损伤加重。这些研究提示特定miRNAs分子对于ALI的发生具有重要调控作用。值得一提的是，我们前期发现miR-7KD小鼠的肺组织中存在炎症细胞的浸润[7]。因此，miR-7在ALI发生中的确切调控机制仍有待后续深入阐明。

现有的研究显示，固有免疫细胞巨噬细胞、γδT细胞以及适应性免疫细胞中的T细胞等参与了ALI的发生、发展过程[17-19]。如Murdoch等[20]研究显示，γδT参与调节急性炎症下组织的完整和稳态，主要在过敏性气道炎症和气道免疫应答中高表达；Holub等[21]利用肠毒素构建ALI模型发现，BAL中高水平IFN-γ主要是被肺部来源CD11b+Mφ分泌，且这群细胞被明显激活，然而CD4+T细胞及整个T细胞群却明显减少。本研究中，我们进一步分析了模型小鼠BAL的细胞组成变化。结果显示miR-7KD小鼠BAL中固有免疫细胞F4/80+Mφ细胞的比例和绝对数均明显降低；而γδT细胞的比例尽管增加，但总细胞数未见明显改变。适用性免疫细胞方面，miR-7KD小鼠BAL中适应性免疫细胞CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例及绝对数均显著降低。尽管由于未建模的对照小鼠BAL细胞数过少难以分析各亚群组成，但结合到前述BAL总细胞数的变化，我们的研究也提示miR-7KD小鼠ALI发生减轻可能与BAL中免疫细胞的组成改变有关。最后，我们进一步检测了BAL中CD4+T细胞活化和归巢能力变化。结果显示miR-7KD小鼠中CD4+T细胞低表达CD69分子，高表达CD62L分子，提示其活化程度降低，且归巢能力减弱。这些研究结果提示，miR-7KD后ALI发生的改变，可能与免疫细胞功能的变化有关。类似地，Guenin-Macé等[22]研究发现过表达Let-7b可上调T细胞的CD62L表达水平，从而阻止结核杆菌内脂引发的T细胞的归巢效应。我们前期还发现miR-7KD小鼠的肠系膜淋巴结增生且多种免疫细胞的组成比例也显著改变[23]。因此，后续深入探讨miR-7在各免疫细胞功能中的调控作用，不仅对于ALI发生机制，且对于机体免疫自稳的认识均具有重要意义。总之，本研究中我们首次发现miR-7敲减后可显著减轻ALI模型小鼠肺损伤，为后续深入探讨miR-7在ALI发生中的作用及机制，以及后续临床相关生物治疗新靶标开发提供了重要前期实验依据。

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[收稿2015-12-01修回2015-12-14]

(编辑倪鹏)

Effect of microRNA-7 knockdown on pathology of Enterotoxin-induced murine acute lung injury

ZHAO Juan-Juan,XU Hua-Lin,GUO Meng-Meng,TAO Yi-Jing,ZHOU Ya,CHEN Chao,QIN Na-Lin,ZHENG Jing,TIAN Dan，XU Lin.

Department of Immunology,Zunyi Medical University,Talent Base of Biological Therapy of Guizhou Province,Zunyi 563000,China

Objective:To detect the effect of microRNA-7 (miR-7) knockdown on pathology in murine acute lung injury (ALI) model,and preliminarily explore its significance.Methods: Murine ALI model was performed by intraperitoneal injection of Lipopolysaccharide (LPS) (10 mg/kg) into miR-7KD mice and wild-type (wild type,WT) mice respectively.Then,the pathologic injury of lung tissue were observed by HE staining.And total cell count of bronchoalveolarlavage(BAL) was calculated.The relative expression of related cytokines in lung tissue was analyzed by Real-time PCR assay.Furthermore,the changes on proportion of innate immune cells (γδT cell and F4/80 macrophages cell) and adaptive immune cell (CD4+T cell and CD8+T cell) were analyzed by FACS.Meanwhile,the expression of CD62L and CD69,as well as the absolute number,in CD4+T cell were also analyzed.Results: Compared with WT mice,pathological damage in lung tissues was significantly alleviated in miR-7KD mice.Real-time PCR analysis showed that the relative expression of IL-6 was obviously reduced (P<0.01),conversely,relative expression of IL-4 and TGF-β were obviously increased (P<0.05).Furthermore,the total cell number in BAL also reduced significantly (P<0.05).Importantly,FACS analysis showed that the proportion and the absolute number of F4/80+Mφ cells obviously reduced (P<0.05);however,the proportion of γδT cells increased (P<0.05).Moreover,the proportion and the absolute number of CD4+T cells and CD8+T cells were significantly reduced (P<0.05).Finally, the proportion and the absolute number of CD62L+in CD4+T cells were upregulated vigorously,contrastly,the proportion and the absolute number of CD69+in CD4+T cells were notably up-regulated (P<0.05).Conclusion: miR-7 defeciency could significantly ameliorate the pathology of murine ALI,suggesting that it may play an important regulatory role in the development of ALI.

miR-7 knockdown;Acute lung injury;Bronchoalveolar lavage；Immune cell

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.003

赵娟娟(1987年-)，女，在读硕士，初级检验师，主要从事分子免疫学方面的研究。

及指导教师：徐林(1977年-)，男，博士，教授，主要从事肿瘤免疫学和分子免疫学方面研究，E-mail：xulinzhouya@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)09-1257-05

①本文受教育部“新世纪优秀人才计划”项目(NCET-12-0661)和国家自然科学基金(No.31370918)资助。

②遵义医学院医学物理学教研室，遵义 563000。