复方苦参注射液增加耐克唑替尼ALK阳性肺癌细胞H2228对克唑替尼的敏感性

高海祥　闫　莉　苏　艳

(河北省人民医院呼吸内科一科，河北　石家庄　050051)



复方苦参注射液增加耐克唑替尼ALK阳性肺癌细胞H2228对克唑替尼的敏感性

高海祥闫莉苏艳

(河北省人民医院呼吸内科一科，河北石家庄050051)

目的探讨复方苦参注射液是否增加耐克唑替尼ALK阳性肺癌细胞H2228(H2228/CR)对克唑替尼的敏感性。方法采用CCK8方法观察复方苦参注射液、克唑替尼对H2228/CR细胞增殖的影响。取对数生长期H2228/CR细胞，加入不同浓度的复方苦参和克唑替尼,CCK8试剂测定各孔光吸收值(A)，取平均值。计算药物作用72 h后的增殖抑制率。根据抑制率计算相应药物的IC50，然后选择适宜的复方苦参注射液浓度与克唑替尼联合，重复CCK8法，计算两药联合72 h后的细胞增殖抑制率及联合后克唑替尼的IC50，计算逆转倍数。结果复方苦参注射液、克唑替尼对H2228/CR细胞增殖具有抑制作用，该作用与浓度呈正相关。复方苦参注射液、克唑替尼对H2228/CR细胞的IC50分别为584.6 μl/ml和3 426.3 nmol/L。复方苦参注射液联合不同浓度克唑替尼后对H2228/CR细胞较单用克唑替尼增殖抑制作用明显增强，联合用药后克唑替尼的IC50为494 nmol/L，逆转耐药倍数为6.93。H2228/CR对克唑替尼敏感性明显增强。结论相对单一应用克唑替尼易产生耐药性的缺点，二者联合运用可有效提高H2228/CR对克唑替尼敏感性。

耐克唑替尼ALK阳性肺癌细胞H2228(H2228/CR)；复方苦参注射液；克唑替尼

治疗非小细胞性肺癌(NSCLC)的靶向药物中，表皮生长因子受体(EGFR)和间变性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶(ALK)抑制剂(TKIs)最常用，它可使带有EGFR突变和(或)ALK融合基因的NSCLC患者症状得到明显改善、提高生存率〔1〕。克唑替尼作为ALK抑制剂在临床试验中表现尤为突出，经克唑替尼治疗的患者90%以上肿瘤缩小，57%的患者获得客观缓解〔2〕。在2013版美国国立综合癌症网络(NCCN)指南上，推荐其作为一线治疗药用于ALK阳性的NSCLC患者。但几乎所有经其治疗的患者在初次治疗9～12个月后均出现了耐药〔3〕，如何降低耐药性，已成为靶向药物治疗NSCLC患者的最大难题。本研究根据复方苦参注射液能够抑制肿瘤血管形成从而控制肿瘤生长〔4〕的临床用药经验，通过体外实验进一步验证复方苦参注射液是否能增加耐克唑替尼ALK阳性肺癌细胞H2228(CH2228/CR)对克唑替尼的敏感性。

1　材料和方法

1.1材料耐克唑替尼ALK阳性肺癌H2228细胞(购自ATCC)； 克唑替尼(美国辉瑞公司)；复方苦参注射液(山西振东金晶制药有限公司)；胆囊收缩素八肽(CCK8)试剂(日本同仁)；酶联免疫检测仪(奥地利TECAN公司)

1.2方法应用CCK8方法观察复方苦参注射液、克唑替尼对〔H2228/(CR)〕细胞增殖的影响。取对数生长期的H2228/CR细胞，用 0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液后，用全自动细胞计数仪计数，以3×104/ml细胞浓度接种于96孔板中,100 μl/孔,其中1孔留作空白组，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，以使细胞充分贴壁。然后加入不同浓度的复方苦参注射液和克唑替尼,使得复方苦参注射液每孔终浓度分别为50、100、200、400、800 μl/ml，克唑替尼每孔终浓度分别为10、30、90、270、810 nmol/L，阴性对照组每孔加入100 μl普通培养液，空白孔加200 μl普通培养液(不加细胞)，每个浓度组设3个复孔。再次置于培养箱中培养72 h，每孔加入CCK8试剂20 μl，继续温育2 h，最后采用酶标仪测定各孔OD值，波长取450 nm。取3个复孔的平均值。计算药物作用72 h后的增殖抑制率。抑制率=〔1-(实验组平均OD值-空白组平均OD值)/(阴性对照组平均OD值-空白组平均OD值)〕×100%。根据抑制率计算两种药物的IC50，选择适宜的复方苦参注射液浓度与克唑替尼联合作用于H2228/CR细胞，重复CCK8方法，计算两药联合72 h后的细胞增殖抑制率，计算逆转倍数。

1.3统计学方法应用SPSS19.0软件行t检验。

2　结　果

2.1复方苦参注射液、克唑替尼对H2228/CR细胞增殖的影响复方苦参注射液、克唑替尼对H2228/CR细胞增殖具有抑制作用，该作用与浓度呈正相关，即浓度越大，抑制作用越强。复方苦参注射液50、100、200、400、800 μl/ml组细胞抑制率分别为(1.2±0.5)%、(4.5±1.3)%、(10.3±2.1)%、(32.1±4.5)%、(66.7±9.7)%；克唑替尼10、30、90、270、810 nmol/L组细胞抑制率分别为(2.8±0.5)%、(6.2±0.9)%、(11.9±1.6)%、(16.7±1.8)%、(29.7±3.4)%。根据冦氏改良公式，复方苦参注射液、克唑替尼对H2228/CR细胞的IC50分别为584.6 μl/ml和3 426.3 nmol/L。

2.2复方苦参注射液联合克唑替尼对H2228/CR细胞增殖的影响根据复方苦参注射液对H2228/CR的增殖抑制作用结果，选择浓度为100 μl/ml苦参注射液与不同浓度克唑替尼联合作用于H2228/CR，表明复方苦参注射液联合不同浓度克唑替尼后对H2228/CR细胞较单用克唑替尼增殖抑制作用明显增强，联合用药后克唑替尼的IC50为494 nmol/L，逆转耐药倍数为6.93。H2228/CR对克唑替尼敏感性明显增强。见图1。

图1　克唑替尼单用与联合复方苦参对H22288/CR细胞增殖的影响

3　讨　论

克唑替尼属靶向治疗药物，是ALK竞争性抑制剂。药理作用为剂量依赖式抑制细胞内ALK与抑制c-Met激酶，从而抑制肿瘤细胞的生长〔5〕。3%～7%的NSCLC患者ALK基因阳性，因此，自克唑替尼应用以来，NSCLC ALK阳性患者中位生存时间和生存率明显提高〔6～8〕。然而，这部分患者在经过1～2年治疗后出现不同程度的克唑替尼耐药现象。耐药的机制可能为:(1)ALK继发性耐药突变。ALK继发性耐药突变约占耐药原因的37%，其中ALK激酶区突变约占28%，而ALK基因拷贝数扩增占9%。ALK激酶区突变是最早明确的耐药机制〔9〕。体内外研究显示，ALK激酶区突变包括L1196M、L1152R、G1202R、G1269A、1151Tins、S1206Y、C1156Y、F1174C和D1203N。(2)驱动基因转换。ALK阳性肿瘤细胞的生长和迁移主要受ALK及其下游信号通路来实现，当克唑替尼阻断该信号通路时，肿瘤细胞则通过驱动基因转换激活其他信号传导通路替代原有通路。这些转换驱动基因中最为常见的是EGFR突变或磷酸化、KRAS突变和c-KIT扩增。(3)肿瘤异质性。NSCLC是基因突变和细胞异质性最大的肿瘤之一。同一ALK阳性NSCLC患者，可能存在两种不同的激酶及突变，另外，不同的时间检测也可能出现不同的驱动基因突变。

祖国医学认为热毒瘀结是肺癌发病机制主要特征之一，故清热解毒法作为肺癌治疗的基本法则在临床上广为应用。复方苦参注射液又名岩舒，主要功效为清热解毒，散结消肿。主要由苦参、土茯苓等多味中药组成。其中苦参具有清热、解毒、燥湿作用，现代药理研究认为苦参的主要成分为苦参碱。其作用机制为通过影响端粒酶活性，杀伤恶性肿瘤细胞，同时诱导肿瘤细胞分化、促进肿瘤细胞凋亡。还可提高正常细胞免疫功能，对自然杀伤细胞和 T细胞亚群作用明显，是一种良好的细胞免疫调节剂，最后还可通过阻断肿瘤细胞和内皮细胞的黏附，达到抑制肿瘤细胞的转移的作用〔10〕。土茯苓具有解毒、除湿、止痛功效，现代药理研究认为其主要成分茯苓多糖及茯苓总皂甙具有抗肿瘤作用。复方苦参注射液联合化学治疗及分子靶向治疗各种恶性肿瘤疗效显著,尤其在减毒增效方面，同时具有一定的抗肿瘤作用。陈南江等〔11〕研究发现复方苦参注射液能显著减轻化疗引起的疼痛不适、恶心呕吐、发热乏力等不良反应,提高人体免疫力,抑制恶性肿瘤细胞生长,延长肿瘤患者生存期，提高患者的生活质量。司维柯等〔11〕研究表明,复方苦参注射液不但能对恶性肿瘤细胞具有直接的杀伤作用,而且还能诱导恶性肿瘤细胞分化、促进细胞凋亡,同时还可抑制肿瘤细胞侵袭与转移。

本实验，观察到复方苦参注射液即使在体外对耐克唑替尼ALK阳性肺癌H2228细胞仍具有增殖抑制作用，且抑制作用随药物浓度增加而增加，显示出复方苦参注射液具有多靶点抗肿瘤作用机制。克唑替尼作为ALK抑制剂，前期实验表明其对ALK阳性肺癌H2228细胞有明显抑制作用，IC50为302 nmol/L，与苏翠云〔13〕试验中测得的334 nmol/L极为接近。但是当ALK阳性肺癌H2228细胞对克唑替尼产生耐药后，药物的敏感性明显下降，相应的IC50明显上升。但是与小剂量的复方苦参注射液联合应用后，对细胞增殖抑制作用明显增强，抑制率明显升高。我们推测可能因复方苦参注射液抗肿瘤谱广，作用靶点及信号通路广泛、时间持久、不易耐药，其不但可对恶性肿瘤细胞起到直接的杀伤作用,而且还能诱导恶性肿瘤细胞分化、促进恶性肿瘤细胞凋亡,最后还可抑制肿瘤细胞侵袭与转移，逆转克唑替尼耐药。因此与克唑替尼联合后增效作用明显。本从体外实验进一步验证了复方苦参注射液联合克唑替尼的临床减毒增效作用。

1Rosell R,Carcereny E,Gervais R,etal.Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer(EURTAC):a multicentre,open-label,randomised phase 3 trial〔J〕.Lancet Oncol,2012;13(3):239-46.

2Zou HY,Li Q,Lee JH,etal.An orally available small-molecule inhibitor of c-Met,PF-2341066,exhibits cytoreductive antitumor efficacy through antiproliferative and antiangiogenic mechanisms〔J〕.Cancer Res,2007;67(9):4408-17.

3Chen Z,Fillmore CM,Hammerman PS,etal.Non-small-cell lung cancers:a heterogeneous set of diseases〔J〕.Nat Rev Cancer,2014;14(8):535-46.

4李敏,钱晓萍,刘宝瑞.复方苦参注射液联合热疗抗血管生成作用的实验研究〔J〕.实用临床医药杂志,2007;11(5):57-61.

5Shaw AT,Yeap BY,Mino-Kenudson M,etal.Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK〔J〕.J Clin Oncol,2009;27(26):4247-53.

6Kwak EL,Bang YJ,Camidge DR,etal.Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer〔J〕.New Engl J Med,2010;363(18):1693-703.

7Camidge DR,Bang YJ,Kwak EL,etal.Activity and safety of crizotinib in patients with ALK-positive non-small-cell lung cancer:updated results from a phase 1 study〔J〕.Lancet Oncol,2012;13(10):1011-9.

8Shaw AT,Kim DW,Nakagawa K,etal.Crizotinib versus chemotherapy in advanced ALK-positive lung cancer〔J〕.New Engl J Med,2013;368(25):2385-94.

9Doebele RC,Pilling AB,Aisner DL,etal.Mechanisms of resistance to crizotinib in patients with ALK gene rearranged non-small cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2012;18(5):1472-82.

10王兵,王国俊.氧化苦参碱对肿瘤诱导血管内皮细胞增殖的抑制作用〔J〕.实用肿瘤杂志,2000;15(5):297-300.

11陈南江,李杭,谭诗生.复方苦参注射液联合紫杉醇治疗老年晚期非小细胞肺癌临床观察〔J〕.上海中医药杂志,2006;40(9):22-3.

12司维柯,高利宏,刘斌,等.苦参碱诱导人肝癌细胞分化、凋亡时对 G1细胞周期调节因子的调控〔J〕.癌症,2001;20( 8):848-51.

13苏翠云.克唑替尼、TAE684对EML4-ALK阳性肺癌细胞株H2228作用的研究〔D〕.南宁：广西医科大学,2013.

〔2015-12-31修回〕

(编辑袁左鸣)

2016年度河北省医学科学研究重点课题计划(20160065)

高海祥(1979-)，男，在读博士，主治医师，主要从事呼吸肿瘤、呼吸系统感染性疾病研究。

R734.2

A

1005-9202(2016)17-4159-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.010