白藜芦醇对人急性T淋巴细胞白血病的体外治疗作用及其机制

马丽君，姜中兴，田文亮，何琛，郭荣，孙慧，孙玲，李英梅

(郑州大学第一附属医院，郑州450052)



·论著·

白藜芦醇对人急性T淋巴细胞白血病的体外治疗作用及其机制

马丽君，姜中兴，田文亮，何琛，郭荣，孙慧，孙玲，李英梅

(郑州大学第一附属医院，郑州450052)

目的探讨白藜芦醇对人急性T淋巴细胞白血病的体外治疗作用及其机制。方法 以人T淋巴细胞白血病细胞(Hut78)作为白藜芦醇的作用靶细胞，分别用6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L白藜芦醇处理Hut78细胞24 h，用100 μmol/L白藜芦醇处理Hut78细胞12、24、48 h, 采用CCK-8法测算细胞抑制率。经100、200 μmol/L白藜芦醇分别处理Hut78细胞12、24 h后，用流式细胞术分析Hut78细胞的凋亡情况。 Hut78细胞经100、200 μmol/L白藜芦醇处理48 h,采用Western blotting法检测细胞中C-myc蛋白的表达。结果 白藜芦醇在大于6.25 μmol/L时显著抑制Hut78细胞的增殖，并呈剂量-时间依赖性(P均<0．01)。白藜芦醇可诱导Hut78细胞凋亡，随浓度增加凋亡细胞增多(P均<0．01)。白藜芦醇可呈剂量依赖性下调C-myc蛋白表达(P均<0．01)。结论 白藜芦醇有明显的体外抗人急性T淋巴细胞白血病效应，其作用机制可能与下调C-myc蛋白表达有关。

T淋巴细胞白血病；白藜芦醇；细胞增殖；细胞凋亡；C-myc蛋白

白藜芦醇是广泛存在于葡萄科植物中的多酚类物质，其化学名称为芪三酚，是反式-3,4,5-三羟基-1,2-二苯乙烯，分子式结构为C12H14O3，在我国中药虎杖中有较高的含量，其有较好的抗炎、调节血脂、抑制血小板聚集及保护心血管等多种作用。自Jang等[1]系统地报道了白藜芦醇对肿瘤的抑制作用后，多种癌细胞株研究中已证实，白藜芦醇通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡发挥抗癌作用[2～5]。2014年6月～2015年10月，我们通过体外实验观察白藜芦醇对Hut78细胞株增殖及凋亡的影响，并从分子生物学角度探讨白藜芦醇用于治疗白血病的可能性及其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1材料白血病细胞Hut78细胞株(购自上海生命工程院)、白藜芦醇(纯度为99%，购自美国Sigma公司，批号为R5010)、二甲基亚砜(DMSO，购自美国Sigma公司)、DMEM高糖培养基(购自美国HyClone公司)、小牛血清(购自美国GEMINI公司)、 CCK-8试剂盒(购自日本同仁公司)、 细胞培养CO2孵育箱、异硫氰酸荧光素及碘化丙啶双标记膜联蛋白(Annexin-V、PI，购自上海贝博生物公司)、C-myc抗体(购自abcam公司)、β-actin(购自北京中杉金桥生物有限公司)。

1.2细胞培养Hut78细胞常规培养于含10%的胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U/mL的DMEM高糖培养基中。置于饱和湿度，37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。常规换液传代培养，选择对数生长期的细胞进行试验。

1.3细胞分组及处理 取对数生长期细胞，将细胞浓度调整至1×104/mL接种于96孔板，180 μL/孔，设立空白对照组(只含培养基，不含药物及细胞)、阴性对照组(含细胞悬液，不含药物)和实验组，每组设5个复孔。将白藜芦醇溶解于二甲基亚砜中，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20 ℃冻存备用。用时将储存液逐渐加入至培养基中稀释至所需浓度。实验组分别加入含有不同浓度的白藜芦醇20 μL，使其终浓度为6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L，充分混匀(并使DMSO终浓度不高于0.1%，此浓度对细胞生长无影响)。对照组加入等体积的培养基或细胞悬液。

1.4细胞抑制率的测算采用CCK-8法。将各组细胞置于培养箱中继续培养24 h，然后加入20 μL CCK-8继续培养4 h,于酶标仪450 nm处测定A值，计算细胞抑制率及半数抑制浓度(IC50)。取IC50分别作用于细胞12、24、48 h,计算细胞抑制率。细胞抑制率=[1-(白藜芦醇组A值-空白对照组A值/阴性对照组A值-空白对照组A值)]×100%。

1.5 细胞凋亡率的测算采用Annexin-V法。调整细胞终浓度为2×105/mL，以终浓度100、200 μmol/L的白藜芦醇培养细胞，空白组加入等体积的DMEM培养基，培养24、48 h后收集细胞，以PBS进行洗涤，离心弃上清加入缓冲液，轻轻振荡重悬细胞，加入FITC标记的Annexin-V于4 ℃冰箱避光孵育15 min，加入PI避光染色5 min后，经流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。Annexin-V阴性、PI阴性代表正常细胞，Annexin-V阳性、PI阴性代表凋亡早期的细胞，Annexin-V阳性、PI阳性代表凋亡晚期的细胞。

1.6细胞C-Myc蛋白表达的检测采用Western blotting法。取对数生长期细胞分别加入100、200 μmol/L的白藜芦醇进行培养，并设置对照组(无药物干涉组)，培养48 h后离心收集细胞，以预冷的PBS洗涤细胞3次，将细胞置于冰上，加入适量的细胞裂解液及蛋白酶抑制剂，30 min后离心收集上清液，加入蛋白上样缓冲液置于沸水中煮沸5 min变性。变性后以每孔30 μL点样，经SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳分离,通过电转将凝胶上蛋白样品转移至PVDF膜上，加入相应一抗4 ℃冰箱孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，ECL试剂盒显影，最后进行图片扫描，利用Image J软件分析每条蛋白条带的灰度值，并与相对应内参值相比对。计算相对表达量。各实验组重复3次。

2　结果

2.1白藜芦醇对白血病细胞生长的抑制作用干预24 h后，阴性对照组A值为1.108±0.003，空白对照组A值为0.308±0.004。加入6.25、12.5、25、50、100 、200 μmol/L白藜芦醇后经酶标仪测得A值为1.104±0.003、0.874±0.004、0.798±0.004、0.749±0.002、0.692±0.002、0.605±0.004，细胞抑制率分别为0.5%、29.3%、38.6%、44.9%、52.0%、62.9%。白藜芦醇作用于细胞24 h时与阴性对照组比较，6.25 μmol/L 白藜芦醇作用于Hut78细胞未显示明显的抑制作用(P>0．05 ),12.5 ～ 200 μmol/L 白藜芦醇对Hut78细胞均具有显著的体外增殖抑制作用，且随药物浓度增加，抑制率增加(P均<0．01)。对细胞培养24 h后最高抑制率为62.9%，白藜芦醇作用于Hut78细胞24 h后的IC50为98.7 μmol/L。取100 μmol/L白藜芦醇作用于细胞12、24、48 h后，A值分别为0.811±0.001、0.691±0.001、0.582±0.002，相应抑制率分别为30.6%、51.7%、65.8%，随时间延长细胞抑制率升高(P均<0．01)，白藜芦醇对白血病细胞增殖抑制率在一定范围内呈剂量-时间依赖性。

2.2白藜芦醇对Hut78细胞凋亡的诱导作用药物处理细胞24 h后，100 μmol/L 白藜芦醇作用下细胞早期凋亡率为44.3%，晚期凋亡率为10.1%;200 μmol/L 白藜芦醇作用下细胞早期凋亡率为48.3%，晚期凋亡率为15.6%。总凋亡率分别为54.4%、63.9%。药物处理细胞48 h后，100 μmol/L白藜芦醇作用下细胞早期凋亡率为49.7%、晚期凋亡率为29.2%;200 μmol/L白藜芦醇作用下细胞早期凋亡率为45.2%、晚期凋亡率为46.7%。总凋亡率分别为78.9%、91.9%。白藜芦醇以浓度依赖性诱导细胞凋亡(P均<0.01)。

2.3Hut78细胞C-myc蛋白的表达Hut78细胞经0、100、200 μmol/L白藜芦醇作用48 h,白血病细胞C-myc蛋白相对表达量分别为0.414±0.102、0.212±0.137、0.020±0.002，不同浓度间比较，P均<0.01。

3　讨论

急性白血病是一种造血系统的恶性病变，常表现为白血病细胞在骨髓及其他造血组织中异常增生。白血病的常规治疗方法主要为化疗，但由于目前药物缺乏特异性选择，在杀伤肿瘤细胞的同时，一定程度上也造成正常组织、器官等的功能或器质性损伤(尤其是骨髓和消化道)，不良反应较大。另外，由于耐药性现象，降低了治疗成功率。白藜芦醇作为中药成分，通过一些复杂的过程，可以选择一些敏感细胞进行治疗并诱导凋亡[6]。由于白藜芦醇对骨髓造血系统毒性较小，在治疗白血病中具有潜在的优越性。在三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病的研究中，联合使用白藜芦醇可协同抗白血病并降低不良反应[7]。本研究经过体外实验研究发现，白藜芦醇对白血病细胞具有较好的增殖抑制及诱导凋亡作用，其增殖抑制率在一定范围内呈剂量-时间依赖性，与李覃等[8]研究结论相符合。另有研究报道白藜芦醇可改变白血病细胞生长周期[9]，而细胞增殖大多是由DNA合成的开始阶段细胞周期G1→S期所控制，其是阻断细胞增殖的关键时期[10]。因白藜芦醇对不同肿瘤生长周期分布影响不同，其机制尚不明确，有待进一步研究。

C-myc蛋白是由C-myc基因编码表达的，属于核蛋白，在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用。相关研究表明，在很多肿瘤中可以检测到C-myc基因的扩增，并时常伴随着基因表达的上调，C-myc蛋白的过度表达常作为预后不良的标志。在造血干细胞中，C-myc蛋白在控制造血干细胞自我更新与分化中起着重要作用，保持造血系统自我更新和分化的平衡，在骨髓中C-myc过度表达将导致白血病细胞恶性增殖。C-myc蛋白表达增高在急性髓系白血病和急性T淋巴细胞白血病中均可观察到。近年研究发现，C-myc蛋白除了参与促进细胞增殖外，还参与诱导细胞凋亡。C-myc基因是一个终末分化的负性调节因子，在大多数正常增殖细胞中均有表达，而当细胞终末分化时表达下调。在增殖活跃的细胞及肿瘤细胞中大多都有C-myc的异常表达。C-myc蛋白具有调节细胞增殖与凋亡的双重功能，且实现两种生物学效应的分子结构区域完全相同。C-myc基因表达的失调是多种细胞凋亡的主要诱因，细胞发生凋亡的速度及其对诱导因素的敏感性均依赖于细胞C-myc蛋白的含量。在一些肿瘤细胞经白藜芦醇处理后，出现细胞分化和凋亡现象的同时，还伴有C-myc表达的下调。另有研究报道，在急性髓系白血病的治疗中，C-myc的高表达是耐药白血病细胞的细胞遗传学特征[10]。而目前已有实验证实白藜芦醇可通过多种途径抑制白血病细胞增殖并诱导凋亡。本实验中，随着白藜芦醇浓度的增加，C-myc蛋白表达明显减少，提示这可能是诱导白血病细胞凋亡的机制之一。

本文通过体外实验发现，白藜芦醇具有良好的抗白血病效应，但其具体机制较为复杂，各信号传导通路交互影响，因而其抗白血病机制仍需进一步阐明；且由于白血病细胞类型较多，白藜芦醇对各类型细胞作用不一，敏感性不同，这些问题都需要进一步研究。总之，加强对白藜芦醇抗白血病机制的研究，有可能提供新的临床治疗方案。

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Therapeutic effect and mechanism of resveratrol on human T lymphatic leukemia cells

MALijun,JIANGZhongxing,TIANWenliang,HEChen,GUORong,SUNHui,SUNLing,LIYingmei

(TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect and mechanism of resveratrol (Res) on human T lymphatic leukemia cells (Hut78) . MethodsHuman T lymphocytic leukemia (Hut78) cells were selected as the target cells, which were treated with 6.25, 12.5, 25, 50, 100 and 200 μmol/L Res, respectively. CCK-8 assay was used to detect the cell inhibition rate of Hut78 cells which were treated with 100 μmol/L Res for 12, 24 and 48 h, respectively. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of Hut78 cells which were respectively treated with 100 and 200 μmol/L Res for 12 and 24 h. Western blotting was used to detect the expression of C-myc protein in Hut78 cells which were respectively treated with 100 and 200 μmol/L Res for 48 h.Results Resveratrol whose dose was greater than 6.25 μmol/L significantly inhibited the proliferation of Hut78 cells, and was time- and dose-dependent (allP<0.01). Res induced the apoptosis of Hut 78 cells, which was dose-dependent (allP<0.01). Res own-regulated the expression of C-myc protein which was in a dose-dependent manner (allP<0.01).Conclusion Resveratrol has significant anti-leukemia effect on human T lymphatic leukemia, and its mechanism may be associated with the down-regulated expression of C-myc protein.

T lymphatic leukemia; resveratrol; cell proliferation; apoptosis; C-myc protein

国家自然科学基金资助项目(81070445);河南省医学科技攻关项目(20090349)。

马丽君(1986-)，女，硕士，主要从事血液病基础与临床研究。E-mail:malijun998@163.com

简介：姜中兴(1965-)，男，教授，主要从事血液病基础与临床研究。E-mail:jiangzx313@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.001

R733.7

A

1002-266X(2016)29-0001-03

2016-03-08)