雷公藤甲素对人肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用*

杨　乐

(南阳医学高等专科学校基础部，河南 南阳 473000)



·实验研究·

雷公藤甲素对人肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用*

杨乐

(南阳医学高等专科学校基础部，河南 南阳 473000)

目的：研究雷公藤甲素体外抑制人肝癌HepG2细胞增殖的情况,并初步探讨其机制。方法：雷公藤甲素干预人肝癌HepG2细胞后, 以CCK-8法检测细胞的增殖抑制，DAPI染色检测细胞凋亡形态，Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western blot检测AKT信号通路和pro-Caspase3蛋白的表达。结果：雷公藤甲素可抑制HepG2细胞增殖，4 mg/L 作用24 h 后，细胞抑制率可达( 53±2.8)%；Hela细胞有明显的凋亡形态出现，凋亡率提高；磷酸化蛋白AKT、 pro-Caspase3表达均降低。结论: 雷公藤甲素可在体外抑制人肝癌HepG2细胞生长，可能与抑制HepG2细胞中AKT通路的激活及活化凋亡蛋白Caspase 3有关。

雷公藤甲素；肝癌；凋亡；HepG2

原发性肝癌是人体最常见的恶性肿瘤之一，目前手术和放、化疗等疗效均不显著，且术后复发率较高；因此有必要寻找新的治疗方法[1-2]。雷公藤甲素 (triptilide, TP) 是雷公藤的主要有效成分之一,具有很强的抗感染和免疫抑制等多种药理作用。多项研究表明：雷公藤甲素在体外能显著抑制不同肿瘤细胞增殖[3]，但其对人肝癌HepG2细胞的作用目前国内外鲜有文献报道。本研究以人肝癌HepG2细胞为研究对象，通过雷公藤甲素在体外对其进行干预，观察对HepG2细胞的增值影响，并初步探讨其作用机制,以期为肝癌的临床治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1瘤株

人肝癌HepG2细胞株购自美国标准菌种收藏所(ATCC)，液氮罐保存。所用细胞培养液为含100 mL/L 胎牛血清的DMEM培养基, 在37 ℃、CO2体积分数为50 mL/L 的条件下培养。

1.2药品、试剂与仪器

雷公藤甲素纯品购自中国药品生物制品检定所，批号20131011，实验前以二甲基亚砜(DMSO)溶解后以生理盐水配制成质量分数4 g/L的溶液，使用前新鲜配制。CCK-8试剂盒(批号20131203)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(批号20130514),购自南京凯基生物科技发展有限公司；荧光染料DAPI(批号20130122购自Sigma公司)；p-AKT(批号20130209)、t-AKT(批号20130510)、pro-Caspase3(批号20121227)抗体，购自Santa Cruz Biotechnology。

1.3检测指标

1.3.1细胞增殖抑制率

取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞浓度至1×103个/孔，接种到96孔细胞培养板中，37 ℃培养24 h，加入质量分数为 0，1，2，4 mg/L的雷公藤甲素溶液，培养 24 h后 ,加入 10 μL/孔 CCK-8,继续培养 1.5 h，于酶标仪读取 A450值。细胞增殖抑制率(%) =(A对照组-A实验组)/A对照组×100%

1.3.2HepG2细胞形态观察

药物干预细胞24 h后，弃培养液；40 g/L 多聚甲醛室温固定10 min；PBS洗涤2次； DAPI染色液室温染色10 min，弃去染液；PBS洗涤2次；在荧光倒置显微镜下观察细胞核形态变化。

1.3.3HepG2细胞凋亡情况

以 Annexin V-FITC染色分析细胞凋亡情况。 将HepG2细胞按每孔5×105个接种于6孔板中培养过夜，待细胞生长至对数生长期时，分别加入4 mg/L雷公藤甲素溶液，空白对照组只加入等体积的无血清 DMEM 培养基，继续培养24 h；以质量分数为2.5 g/L 胰酶消化、收集细胞，PBS 洗涤1次，按Annexin V-FITC染色试剂盒操作说明染色后，使用流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况。

1.3.4Western blot检测蛋白相关信号通路蛋白的表达水平

雷公藤甲素作用HepG2细胞24 h后收集细胞,提取总蛋白，定量，分装备用。按Western blot常规操作,用 Image J软件测定各组蛋白的灰度值，除以内参蛋白actin的灰度值，所得结果为各蛋白的相对值。

1.4统计学方法

采用 SPSS 13.0软件行完全随机设计的单因素方差分析 (ANOVA)。以P<0.05为差别有统计学意义。

2　结　果

2.1雷公藤甲素对HepG2细胞的增殖抑制作用

雷公藤甲素对HepG2细胞的增殖抑制作用呈量效关系，其中1，2，4 mg/L的细胞抑制率分别为(20±3.1)%、 (47±2.8)%和(54±2.5)%。

2.2雷公藤甲素对HepG2细胞形态的影响

雷公藤甲素作用肝癌HepG2细胞后，DAPI 染色显示凋亡比率高于对照组细胞，差别有统计学意义(P<0.01)。见图1。

A.空白对照组；B.4 mg/L雷公藤甲素组

2.3雷公藤甲素对HepG2细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，HepG2细胞经过4 mg/L 雷公藤甲素作用 24 h 后，早期凋亡率为 (10.86±0.31) %，与空白对照组早期凋亡率(3.26±0.47) %对比，差别有统计学意义(P<0.01)。见图2。

A.空白对照组;B.4 mg/L雷公藤甲素组

2.4雷公藤甲素对HepG2细胞AKT、pro-caspase3蛋白表达的影响

见图3。Western Blot结果显示, 在雷公藤甲素作用24 h后,与空白对照组对比，肝癌HepG2细胞p-AKT表达降低，且出现Caspase 3的活化,Actin作为内参物。

图3　质量分数0，1，2，4 mg/L的雷公藤甲素对HepG2

3　讨　论

自从 Kupchan 等[4]首次发现雷公藤甲素的抗肿瘤活性以来，人们对雷公藤甲素治疗癌症的功效作了大量的研究。本研究以人肝癌HepG2细胞为靶细胞，通过CCK-8法检测了雷公藤甲素对其的增殖抑制，以荧光染色结合流式细胞术对肿瘤细胞的形态和凋亡率进行了观察，并通过Western Blot对AKT和Pro-caspase3蛋白的表达进行了检测,结果显示:雷公藤甲素可明显抑制人肝癌HepG2细胞的生长，并可导致其发生凋亡，呈量效关系。此可能与雷公藤甲素抑制HepG2细胞中AKT通路的激活、活化凋亡蛋白Caspase 3有关。

[1]Ferrarezi DA, Cheurfa N, Reis AF, et al.Adiponectin gene and cardiovascular risk in type 2 diabetic patients: a review of evidences[J].Arq Bras Endocrinol Metabol,2007,51(2):153-159.

[2]Halleux CM, Takahashi M, Delporte ML, et al.Secretion of adiponectin and regulation of apM1 gene expression in human visceral adipose tissue[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,288(5):1102-1107.

[3]Tengchaisri T, Chawengkirttikul R, Rachaphaew N, et al.Antitumor activity of triptolide against cholangiocarcinoma growth in vitro and in hamsters[J].Cancer Lett,1998,133(2):169-175.

[4]Kupchan SM, Court WA, Dailey RJ, et al.Triptolide and tripdiolide, novel antileukemic diterpenoid triepoxides from Tripterygium wilfordii[J].J Am Chem Soc,1972,94(20):7194-7195.

(编辑陶珠)

1001-6910(2016)02-0071-02

R735.7

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.02.33

南阳市科技攻关项目(2013GG058)

2015-06-25；

2015-12-01