四神丸对溃疡性结肠炎模型大鼠血清IL-23、IL-27含量和结肠黏膜Foxp3 mRNA表达的影响*

程小丽，朱向东，王　燕，郭婷婷，张晓婧

(甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000)



·实验研究·

四神丸对溃疡性结肠炎模型大鼠血清IL-23、IL-27含量和结肠黏膜Foxp3 mRNA表达的影响*

程小丽，朱向东，王燕，郭婷婷，张晓婧

(甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000)

目的：观察四神丸针对溃疡性结肠炎模型大鼠血清中IL-23、IL-27含量和结肠组织中Foxp3 mRNA表达的影响，探讨四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎的作用机制。方法：使用TNBS/乙醇溶液灌肠、番泻叶灌胃联合氢化可的松腹腔注射复制脾肾阳虚型溃疡性结肠炎的大鼠模型。将120只大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，四神丸低剂量组、中剂量组、高剂量组和SASP组，通过药物进行干预治疗，利用光镜观察结肠组织病理形态并进行评分，采用ELISA检测法检测大鼠血清中的IL-23和IL-27水平，RT-PCR检测法检测Foxp3mRNA表达水平。结果：与空白对照组对比，模型对照组大鼠结肠组织的黏膜层有炎症和溃疡发生，证实模型成功。与空白对照组对比，模型对照组大鼠血清的IL-23、IL-27含量显著升高，结肠组织Foxp3基因表达量明显下降，差别有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组对比，四神丸低、中、高剂量组和SASP组血清IL-23 、IL-27水平降低，结肠组织Foxp3基因表达量升高，差别有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。结论：四神丸有可能是通过对促炎因子lL-23、IL-27的下调表达，对Foxp3基因的表达量进行升高表达，从而调节肠道中的异常免疫反应，起到防治溃疡性结肠炎的作用。

四神丸；溃疡性结肠炎；IL-23；IL-27；Foxp3；作用机制；动物；大鼠

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是较为常见的炎症性肠病(inflam-matory boweLdisease，IBD)之一，也是一种非特异性的免疫性炎症[1]，其病变部位好发于直肠和结肠，多表现为腹泻、腹痛、黏液脓血便、里急后重,具有易反复、病程迁延、不易治愈的特点。若任其发展，则有并发症多、癌变的倾向，从而严重影响患者的生活质量[2]。UC的病因和发病机制，目前尚不十分明确，多数学者认为其发病与免疫、饮食、遗传、环境，及心理等诸多因素有关，其中免疫系统的异常和紊乱被认为是最为密切的影响因素。现代医学通常使用磺胺类药物、激素治疗，但常因其副作用较大、患者难以耐受而使用受限。中医学无UC这一病名[3]，根据其临床表现多以腹泻予以治疗，而四神丸为治疗腹泻的经典方剂之一[4]，且运用四神丸治疗脾肾阳虚型溃疡性结肠炎有显著疗效；只是该方法治疗溃疡性结肠炎的现代科学机制尚未得到阐明。本研究遵循中医辨证论治的精髓，采用复合法建立大鼠 UC 模型，通过观察四神丸的疗效，以及从免疫学的角度探讨该疗效机制，为四神丸的广泛临床运用以及进一步的开发提供有力的依据。

1　材料与方法

1.1动物

SPF级Wistar大鼠120只，雌雄各半，体质量(180±20) g，由甘肃中医药大学实验中心提供，动物合格证号：SCXK(甘)2011-0001。饲料亦由以上单位提供。

1.2药品、试剂与仪器

四神丸源自《证治准绳》，由甘肃中医药大学附属医院药剂室制备。按照原方2∶4∶2∶1∶2∶2比例取肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸、生姜、大枣，用8倍量 700 g/L的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取药渣。合并3次醇提取液，滤过，滤液减压回收乙醇后得醇提取浓缩液，将其干燥后得干膏，将干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏，4 ℃冰箱保存备用。柳氮磺吡啶(SASP)，0.25 g/片，上海三维制药有限公司产品，批号H32020026；番泻叶水煎液，由甘肃中医药大学附属医院制剂室熬制加工，药材购自兰州惠仁堂药店；氢化可的松注射液，天津药业焦作有限公司产品，批号11080411。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，北京邦定泰克生物技术有限公司产品，批号2008-16-2；大鼠IL-23、IL-27检测试剂盒，深圳市达科为生物技术有限公司产品，批号20150502B；PCR引物设计，北京金唯智生物科技有限公司产品，批号108030404；TrizoL试剂(批号 19919)、琼脂糖(批号 0000101394)，均为Invitrogen 公司产品；反转录试剂盒(批号 0000007526)、PCR 试剂盒(批号 108030404)，均为Promega Corporation公司产品；异丙醇，天津市百世化工有限公司产品；三氯甲烷、无水乙醇，均为天津市化学试剂工厂产品； 二抗大鼠SP检测试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号13135A05。Biorad iMark酶标仪，美国BLO-RAD公司产品；CT14RD高速冷冻离心机，天美科技有限公司产品；303-2型恒温培养箱，北京科伟永鑫实验设备仪器公司产品 ；S1000TM型PCR仪、BIO-RAD凝胶成像仪，均为美国伯乐公司产品。

1.3动物分组、模型的建立与给药

将大鼠按随机数字表法随机分为空白对照组，模型对照组，SASP组和四神丸低、中、高剂量组6组，每组各20只。采用TNBS/乙醇溶液灌肠、番泻叶灌胃联合氢化可的松腹腔注射法制作脾肾阳虚型UC大鼠模型：将大鼠正常饲养1周，待其体质量(180±20)g时，空白对照组以蒸馏水(每只3 mL/d)灌胃、生理盐水(每只1 mL/d)腹腔注射；其余5组以番泻叶(每只3 mL/d)灌胃、氢化可的松(每只5 mg/d)腹腔注射，共计21 d。21 d后，将Wistar大鼠禁食、不禁水24 h，用100 g/L水合氯醛(3 μL/g)腹腔麻醉，用橡胶输液管轻缓注入大鼠距肛门7～8 cm 深的肠腔内，将TNBS/乙醇液(100 ng/g+500 g/L 的乙醇0.25 mL)溶液注入，留置数分钟；用针头抽取少量空气，采用同样方法注入大鼠肠腔，以防治溶液外漏。灌肠结束后，让动物保持平躺状态，自然清醒。空白对照组大鼠采用同样方法用等量的生理盐水灌肠。

于造模结束第2天开始灌胃治疗，每日1次，连续21 d。四神丸低、中、高剂量组分别按生药1.12，2.24，4.48 g/(kg·d)的剂量(按照临床成人用量的2.5，5及10倍折算)灌胃，SASP组按0.3g/kg剂量灌胃，空白对照组、模型对照组以等体积的生理盐水灌胃，灌胃体积均为10 μL/g。

1.4检测指标

治疗21d 后，乙醚麻醉大鼠，股动脉采血，取血清用于 ELISA 法检测血清IL-23、IL-27含量；脱颈处死大鼠，取病变最严重处结肠5～8 cm，用冷PBS清洗结肠，肉眼观察结肠损伤情况并评分；取病变最明显处0.5 cm左右，迅速移至液氮中保存，用于免疫组化和基因表达检测。

1.4.1一般情况

在造模及治疗期间观察各组大鼠精神、毛色、饮食、大便等情况。

1.4.2血清IL-23、IL-27含量检测

采用ELISA法测定血清IL-23、IL-27含量，实验步骤严格按试剂盒要求操作。在检测波长450 nm和校正波长620 nm同时读板，通过标准曲线计算各样本含量。

1.4.3结肠组织大体形态

大体形态损伤评分参照Luketal标准[5]进行。0分：无损伤。1分：充血但没有溃疡。2分：充血而且肠壁变厚但没有溃疡。3分：有一处小溃疡，直径0～1 cm。4分：溃疡较大，直径1～2 cm，但肠管与外周脏器无粘连。5分：溃疡直径1～2 cm，肠管增厚，与周围脏器粘连严重。

1.4.4结肠组织中Foxp3蛋白的定位表达

采用免疫组化SP法。主要步骤：固定石蜡切片，将其常规脱蜡。每张切片滴加体积分数 30 mL/L 的H2O2，于室温放置 10 min。将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH值6.0)中进行抗原热修复，自然冷却至室温。滴加50 g/L的BSA 封闭液，室温放置20 min。分别滴加Foxp3一抗，4 ℃冰箱过夜。滴加生物素化山羊抗兔 IgG，于37 ℃培养箱孵育20 min。滴加试剂 SABC，于37 ℃培养箱孵育 20 min。加DAB 显色剂，苏木素轻度复染3 min；经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。通过显微镜观察结果，拍片。同一组片中，用PBS 代替一抗作孵育，其余步骤同上，来进行染色对照。Foxp3蛋白主要表达于大鼠结肠组织中的肠道黏膜及黏膜下层，尤以胞浆为主。Foxp3表达阳性为胞质呈棕黄颗粒染色，颜色越深则表明表达越强；若未出现棕黄颗粒则为阴性。采用 BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统，随机选取 5 个视野，测量阳性细胞平均积分光密度值(IOD)，其值越大则表明蛋白表达强，反之则表达弱。

1.4.5大鼠结肠组织中Foxp3的水平以及表达

采用RT-PCR法检测。RNA的提取采用经典的Trizol法，通过Bio-RAd核酸定量分析仪测定总 RNA 的浓度和纯度，确保 2.0>A260/A280>1.8。参照反转录试剂盒说明书进行反转录,合成 cDNA,用 cDNA模板对大鼠内参照β-actin 及Foxp3基因分别进行PCR 扩增，引物由金唯智生物科技北京有限公司合成。内参照β-actin 引物序列为：上游引物 5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游引物5′-AAGGGTGTAAAACACAGCTC-3′，扩增产物长度 292 bp。Foxp3引物序列为：上游引物5′-AAAGTGGCAGGGAAGGAGTG-3′，下游引物5′-CAAGTCTCGTGTGAAGGCAGA-3′，产物长度 196 bp。扩增反应体系为 50 μL,其中 cDNA 3 μL、上下游引物各 1 μL；MgCl23 μL、10×Reaction Buffer 5 μL、dNTP Mix 1 μL；Tap DNA 聚合酶 0.25 μL；无酶水补足至50 μL。扩增参数为：预变性95 ℃、2 min，95 ℃变性 45 s，退火 53 ℃、45 s,72 ℃、延伸30 s，共40个循环(β-actin为25个循环)，总延伸72 ℃、5 min。PCR 扩增产物于 10 g/L琼脂糖凝胶中电泳,在凝胶成像仪上成像,采用 Quantity One 图像分析软件分析数据,获得各电泳条带的积分光密度(X)，用β-actin 的积分光密度(A)作为内参照，计算基因的相对表达量(X/A)。

1.5统计学方法

2　结　果

2.1各组大鼠一般情况对比

空白对照组：大鼠皮毛光泽顺滑，反应灵活，精神、饮食正常，大便正常。模型对照组：造模完成时，大鼠精神萎靡、活动减少，大便清稀不成形，毛发松散无光泽，爪甲颜色较淡，尾巴变凉，弓背倦怠，喜扎堆，饮食、饮水量显著下降。自造模第2天，大鼠出现持续稀便、肛周污浊、毛色晦暗无光泽且有被粪便沾染的现象，部分大鼠出现肉眼可见的血便。第7天，上述现象最为突出，是病证最显著阶段。因为大鼠自身有一定的修复功能，自第14天开始上述症状有一定程度的改善，第21天改善较为明显，饮食增多，皮毛较前洁净顺滑，大便较前略成形，反应较前灵敏。其余各治疗组经过治疗后症状均有不同程度的改善，SASP组大鼠皮毛较有光泽，反应较灵敏，精神较正常，活动尚灵敏，饮食尚可，大便基本正常，个别有稀便现象；四神丸组大鼠皮毛光泽，反应灵活，精神活动可，饮食接近正常，大便呈颗粒状，其中中剂量组各症状恢复最好，与空白对照组对比基本无异。

2.2各组大鼠血清IL-23、IL-27水平对比

与空白对照组对比，模型对照组大鼠血清IL-23、IL-27含量升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，四神丸高、中、低剂量组和SASP组血清IL-23 、IL-27水平降低，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组 别动物数剂量/(g·kg-1)IL-23/(ng·L-1)IL-27/(ng·L-1)空白对照组2008.5863±0.330910.0378±0.9794模型对照组0209.9217±0.4344**8.8211±0.8449**SASP组200.468.3898±0.5932#10.0144±0.6148##四神丸低剂量组2011.188.3855±0.5531#9.9243±0.8579#四神丸中剂量组2022.378.3052±1.4298#9.7982±0.4151#四神丸高剂量组2044.738.2952±0.4982#9.8748±0.4082#

注：与空白对照组对比，**P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05，##P<0.01。

2.3各组大鼠结肠组织大体形态对比

模型对照组大鼠结肠黏膜可见明显的充血、水肿、溃疡，肠壁变厚、肠道缩短等。经过3种剂量四神丸和SASP治疗后，大鼠结肠黏膜损伤情况均有改善，但各组具体的修复情况不同。其中，SASP组和四神丸中、高剂量组的大鼠黏膜仅存在少量的充血水肿，其余损伤基本恢复至正常形态。四神丸组、SASP 组与模型对照组对比，结肠损伤评分降低，差别有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2　各组大鼠结肠组织大体形态评分对比　　±s

注：与空白对照组对比，**P<0.01；与模型对照组对比，##P<0.01。

2.4各组大鼠结肠组织Foxp3基因表达量对比

与空白对照组对比，模型对照组大鼠结肠组织Foxp3基因表达量下降，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，四神丸高、中、低剂量组和SASP组Foxp3基因表达量升高(P<0.05)。见表3。

组 别剂量/(g·kg-1)Foxp3相对表达量空白对照组00.9086±0.1477模型对照组00.4725±0.1108**SASP组0.460.8472±0.0806#Δ*四神丸低剂量组11.180.8762±0.0870#Δ*四神丸中剂量组22.370.6641±0.3281#四神丸高剂量组44.730.7506±0.0493#

注：与空白对照组对比，**P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05；与四神丸中剂量组对比，△P<0.05；与四神丸高剂量组对比，＊P<0.05。

3　讨　论

溃疡性结肠炎属中医学“痢疾”“肠风”“肠癖”“便血”“泄泻”“带下”“脏毒”等范畴。中医学认为：UC的发生由饮食、劳倦、情志损伤等多重因素相互作用使五脏失调所致，湿邪是其最主要的致病因素之一。脾主运化水湿，虽然UC的病变部位在肠，但中医学认为本病的发生、发展与脾有着密切关系。UC病程较长，根据久病及肾理论，该病易损伤肾脏，从而引起肾虚。肾主二便，肾虚则气化不行，大便失约而为泄泻，故目前临床治疗应从脾虚泄泻、肾虚泄泻来论治。四神丸是治疗五更泄泻的经典名方之一，临床治疗UC临床疗效显著，但作用机制不明。

目前，免疫因素是UC发病研究的热点之一[7]。IL-23、IL-27为新近发现的IL-12之家族成员，与IL-12组织结构类似、生物功能相近，可以参与免疫系统疾病、感染性疾病，以及肿瘤等多种免疫调节过程[8]，尤其是在慢性肠病发病中起着重要的免疫调节作用。IL-23归属于介导细胞免疫的因子之一，主要来源于活化的树突状细胞与巨噬细胞。IL-23不仅参与机体的抗感染免疫和抗肿瘤免疫，还在自身免疫性疾病的发病和长期慢性复发性炎症中起着不可或缺的作用。IL-23可诱导T细胞产生多种细胞因子，如IL-17、IL-10、IFN-γ等[9]，其中，IL-17为已被证实为促炎因子，其可诱导中性粒细胞进行增殖、成熟和趋化，从而促使T细胞活化与增殖；此外，还可以促进TNF、IL-1、IL-6等促炎细胞因子的释放。有文献[10]报道，IL-23是引发肠道炎症的关键介质之一。IL-27主要由活化的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞产生，表达部位主要在髓细胞系。IL-27作用于免疫反应早期阶段，通过STAT1、T-bet途径使CD4+T细胞增殖，使其向Th1细胞方向分化；同时可协同IL-12刺激细胞产生IFN-γ，促进单核细胞产生TNF、IL-1、IL-12等炎性细胞因子[11]，从而导致炎症的发生。另一方面，在Th1细胞高度活化时，IL-27还可通过抑制Th2和Th17细胞的分化，从而促进IL-10的产生，抑制炎症因子IL-2的分泌，进而抑制Th1型免疫反应从而达到抗炎作用[12]。

Foxp3是叉状头转录因子的家族成员之一[13]，与调节性T细胞(Treg)的发育、分化和功能发挥密不可分[14]，被认为是属于Treg的标志性分子。Treg细胞是具有免疫调节功能的一类T细胞亚群，在多种免疫性疾病中有着重要作用。虽然其具体的作用机制尚不清楚，但越来越来多的研究证明：Treg细胞能通过多种机制来抑制免疫应答，在维持机体内环境的稳定中发挥重要的作用。研究发现，Foxp3基因敲除或突变的小鼠，由于CD4+CD25+Treg细胞数量减少，Foxp3表达缺陷，其自身免疫病的发病率大大增高。在人类体内，同源的Foxp3突变有引起基因性疾病的可能性，如肠病、免疫失调、内分泌疾病等[15]。由此可知，Foxp3可能是影响自身免疫性疾病发病机制的重要因子之一，其突变或缺失能够引起严重的自身免疫性疾病。本研究结果显示：与空白对照组对比，模型对照组大鼠血清的IL-23、IL-27含量普遍升高，结肠组织Foxp3基因表达量明显下降，差别有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组对比，四神丸低、中、高剂量组和SASP组血清IL-23、IL-27含量降低，结肠组织Foxp3基因表达量升高，差别有统计学意义(P<0.05)。结果表明：四神丸可能是通过下调促炎因子lL-23、IL-27表达，升高Foxp3基因表达量，来调节肠道中的异常免疫反应，从而达到防治UC的作用。

[1]朱立，王新月.溃疡性结肠炎病因病机理论探讨[J].杏林中医药，2010,30(1)：10-11.

[2]崔俊峰，王建民，李明.中医药治疗溃疡性结肠炎研究进展[J].中医药临床杂志，2011，23(1)：92-93.

[3]吴春江, 李志涛, 赵双梅.中医药治疗溃疡性结肠炎研究进展[J].云南中医中药杂志，2009, 30(6):72-74.

[4]杜波，王婧.四神丸合理中汤加味治疗溃疡性结肠炎76例[J].中医杂志，2011，52(20)：1778-1779.

[5]国家中医药管理局医政司.中医临床诊疗术语[M].北京:中国标准出版社，1997.

[6]Hristine C, Michel C, Lecannu G.The Prebiotic characteristics of fructooligosaccharides are necessary for reduction of TNBS-induced colitis in rats[J].J Nutr,2003,133(1)：21-27.

[7]刘杰民,王敏,黄贵华,等.溃疡性结肠炎由脾及肾病机演变规律初探[J].中国中医药信息杂志，2011,18(8): 94-95.

[8]Shimizu M,Shimamura M,Owaki T,et al.Antiangiogenic and antitumor activities of IL-27[J].J Immunol,2006,176(12):7317-7324.

[9]dePaus RA, van de Wetering D, van Dissel JT, et al.IL-23 and IL-12 responses in activated human T cells retrovirally transduced with IL-23 receptor variants[J].MoL Immunol，2008，45(15): 3889-3895.

[10]Yen D, Cheung J, Scheerens H, et al.IL-23 is essentiaLfor T cell-mediatedcolitis andPromotes inflammation via IL-17 and IL-6[J].J Clin Invest,2006,116(5):1310-1316.

[11]Takeda A, Hamano S, Yamanaka A, et aL.Cutting edge: role of IL-27/WSX-1signaling for induction of T-bet through activation of STATLduring initial ThL commitment[J].J Immunol,2003,170(10):4886-4890.

[12]Stumhofer JS,Laurence A,Wilson EH, et aL.Interleukin 27 negatively regulates the development of interleukin 17-producing T helper cells during chronic inflammation of the centraLnervous system[J].Nat Immunol,2006,7(9):937-945.

[13]Hori S,Nomura T, Sakaguchi S. ControL of regulatory T celL development by the transcription factor Foxp3[J].Science,2003, 299(5609):1057-1061.

[14]孔珍珍,李付广.Foxp3在CD25+CD4+调节性T细胞发育和功能中作用的研究进展[J].国际免疫学杂志,2010(33): 205-08.

[15]Khattri R, Cox T,Yasayko SA,et al.An essentiaLrole for Scurfin in CD4+CD25+T regulatory cells[J].Nat Immunol,2003(4):337-342.

(编辑陶珠)

1001-6910(2016)02-0066-05

R574.62

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.02.32

朱向东，教授，博士，zhuxiangdong33@163.com

国家自然科学基金资助项目(BH-2013-8)

2015-05-08；

2015-12-03