人类Izumo4和Tssk6在精子顶体反应前后的定位检测*

吴昊天，梁磊

（1.内蒙古呼和浩特市第二中学，内蒙古呼和浩特010010；2.内蒙古医科大学附属医院妇产科，内蒙古呼和浩特010018）

人类Izumo4和Tssk6在精子顶体反应前后的定位检测*

吴昊天1，梁磊2

（1.内蒙古呼和浩特市第二中学，内蒙古呼和浩特010010；2.内蒙古医科大学附属医院妇产科，内蒙古呼和浩特010018）

目的鉴定人Izumo4和Tssk6在精子顶体反应前后的位置。方法在实验室自制小鼠抗人Izumo4和Tssk6多克隆抗体，采用免疫组织化学法分别检测顶体反应前后Izumo4和Tssk6在人精子中所处的位置。结果顶体反应前，经抗HIS-Izumo4多克隆抗体处理的精子在头部赤道靠上部位染色稍浅，而赤道上膜染色稍深，经抗HIS-Tssk6多克隆抗体处理的精子在尾部和赤道靠上部位染色较深。顶体反应后，经抗HIS-Izumo4和抗HIS-Tssk6腹水处理过的精子顶体膜均明显破裂且对3-氨基-9-乙基咔唑染色剂不显色。结论Tssk6位于精子头部的顶体内部及精子尾部，Izumo4位于顶体外膜上。

Izumo4；Tssk6

顶体反应是哺乳动物受精的重要环节之一，直接导致精卵质膜的融合，卵子上的CD9蛋白是精卵融合的必要分子，INOUE等[1]通过克隆技术在小鼠精子上发现类似的蛋白Izumo。在众多参与哺乳动物精卵融合的精子蛋白质中，Izumo家族成员Izumo1-4、Tssk家族成员Tssk6被认为与顶体反应密切相关[2-4]。Tssk6在雄性睾丸组织中，特别是在睾丸中的精子上特异性表达的一个丝氨酸蛋白激酶家族成员，于精原细胞减数分裂后至精子细胞形成期间即开始表达，对于精子顶体、精子形态及其功能具有重要意义[5-7]。来自人和小鼠的实验数据显示，Tssk6在精子的顶体内部和精子头部前段均有表达[5]。Tssk6含有一个丝氨酸/苏氧酸磷酸化激酶结构域，可以通过影响丝状肌动蛋白（filamentous actin，F-actin）的聚合作用来影响Izumo蛋白在顶体反应后的重新定位[3]。另有研究表明，大鼠和人的Izumo4蛋白在精子顶体反应前位于精子头部前端，顶体反应后检测不到Izumo4蛋白，据此推测虽然Izumo4并不是跨膜蛋白，但很可能参与精卵融合的某个重要环节[2]。

目前对于人Izumo4和Tssk6在顶体反应前后的位置分布还不清楚，为此本实验使用自制的小鼠抗人Izumo4和Tssk6多克隆抗体，通过免疫组织化学法对顶体反应前后Izumo4和Tssk6在人精子中所处的位置分别进行检测。

1 材料与方法

1.1精液标本的收集

人类正常精液样本选取标准：精液体积2～5ml，颜色淡黄或灰白色，pH 7.2～7.8，30 min完全液化，密度≥20×106个/ml，活力A级≥25%，或A+B级≥50%，存活率≥50%，形态正常≥35%，白细胞< 1×106个/ml。

1.2主要试剂与工具酶

免疫组织化学法染色试剂盒购于武汉博士德公司，小鼠抗人Izumo4和Tssk6多克隆抗体为本课题组自制。

1.3人Izumo4和Tssk6在精子中的定位检测

顶体反应发生前，在精子的头部前端可以检测到Izumo4的存在，而顶体反应发生后则检测不到，Izumo4虽不是跨膜蛋白，但对于精卵的顺利融合却至关重要。本实验使用前期实验室自制的小鼠抗人Izumo4和Tssk6多克隆抗体，通过免疫组织化学法，分别检测顶体反应前后Izumo4和Tssk6在人精子中所处的位置。

1.3.1顶体反应前Izumo4和Tssk6在人精子中的位置①人类精液置于恒温培养箱37℃完全液化，用美国Vitrolife公司的Sperm Grad和Sperm Rinse（90%和45%两个浓度）梯度离心法纯化精子。收集沉淀，加入1.5ml SpermRinse混匀后离心，将精子沉淀移至另一15ml离心管，加入1.5ml SpermRinse吹打混匀，取0.5μl样本滴片，于显微镜下观察精子的纯化质量及密度。②沉淀经0.01 mol磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3次，适当稀释后涂片，干燥待用。③将干燥好的涂片放入固定液静置25min，经0.01mol PBS清洗3次，待用。④用含有1%Triton-100的PBS对已固定的精子进行4℃过夜通透处理，PBS清洗3次后按照试剂盒说明书对精子进行免疫组织化学法染色。

1.3.2顶体反应后Izumo4和Tssk6在人精子中的位置①将纯化后的活精子沉淀缓慢推入至1.5 ml Tyrode's buffer底部，于5%的二氧化碳CO2细胞培养箱中培养1.5h获能。②抽提上游好的获能精子，移至含有足量钙离子载体A23187工作液，于5%二氧化碳CO2细胞培养箱中培养1.5h，发生顶体反应。③顶体反应后4℃、1000g离心5min，回收精子。④定位检测步骤同1.3.1中②～④，按照即用型链霉亲和素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）免疫组织化学法试剂盒说明书对精子进行免疫组织化学法染色。

2 结果

2.1精子顶体反应前人lzumo4和Tssk6的定位

使用本实验室自制的腹水多克隆抗体对人精子进行免疫组织化学法染色，选择只经SpermRinse处理的精子作为对照组，检测结果显示，对照组无染色；经抗HIS-Izumo4多克隆抗体处理的精子在头部赤道靠上部位染色稍浅，而赤道上膜染色稍深。经抗HIS-Tssk6多克隆抗体处理的精子在尾部和赤道靠上部位均染色较深。见图1。

2.2人lzumo4和Tssk6在精子顶体反应后的定位

人精子经抗HIS-Izumo4和抗HIS-Tssk6腹水多克隆抗体处理、获能，加入含有钙离子载体的A23187工作液，顶体反应发生后进行免疫组织化学法染色，结果显示，经抗HIS-Izumo4和抗HIS-Tssk6腹水处理过的精子顶体膜均明显破裂，且对3-氨基-9-乙基咔唑染色剂不显色。见图2。

图1　人精子细胞中Izumo4和Tssk6的免疫细胞化学法检测

图2　顶体反应后人精子细胞中Izumo4和Tssk6的免疫细胞化学检测

3 讨论

本实验用纯化过的Izumo4和Tssk6腹水多克隆抗体对人精子做免疫细胞化学分析，经过通透处理后的精子在赤道段至顶体部分有较明显的识别染色。顶体反应发生前的人精子顶体上存有大量Tssk6蛋白，Izumo4相对较少且只明显存在于精子头部顶体外膜之上，而顶体反应后无法检测到Izumo4，该结果与前人对小鼠的研究相符[2]。免疫细胞化学结果显示，人精子顶体反应发生前，Tssk6明显分布于精子的整个顶体及尾部位置，而Izumo4则只分布于顶体膜上[8-9]。顶体反应发生后在精子头部没有检测到Izumo4和Tssk6，可能是随着顶体反应的结束，顶体膜破裂且内含物释放出来，位于顶体位置的Izumo4和Tssk6亦同时流出。笔者认为，虽然Izumo4并不是跨膜蛋白，但似乎与Tssk6通过某种作用被锁定在顶体外膜上，而Tssk6大量分布于精子顶体内的结果亦说明Izumo4和Tssk6并不在精子表面产生。顶体反应发生后,在精子尾部未检测到Tssk6，可能是由于在获能过程中，精子尾部的F-actin要将磷脂酶C从胞质转移到精子膜上，之后F-actin必须被降解才能使精子向卵子接近完成后续过程。考虑到Tssk6对肌动蛋白的聚合作用产生影响，笔者认为，顶体反应完成后，由于精子尾部的鞭毛不再需要具备活动能力，Tssk6随着F-actin的降解而降解，因此在精子尾部无法检测到Tssk6。

综上所述，笔者确定Izumo4和Tssk6蛋白并不直接于人精子表面分泌。Tssk6应该位于精子头部的顶体内部及精子尾部，Izumo4位于顶体外膜上。目前对于Izumo4和Tssk6蛋白在精子顶体内的存在方式还不清楚，两者与同样位于精子表面及顶体内的其他参与质膜融合的蛋白分子的关联作用亦不明确，还需要对Izumo4和Tssk6蛋白在精子上的相互作用机制进行更深入的研究。

[1]INOUE N,IKAWA M,ISOTANI A,et al.The immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs[J]. Nature,2005,434(7030):234-238.

[2]ELLERMAN D A,PEI J,GUPTA S,et al.Izumo is part of amultiprotein family whose members form large complexes on mammalian sperm[J].Mol Reprod Dev,2009,76(12):1188-1199.

[3]SOSNIK J,MIRANDA P V,SPIRIDONOV N A,et al.Tssk6 is required for Izumo relocalization and gamete fusion in the mouse[J]. J Cell Sci,2009,122(15):2741-2749.

[4]GUPTA S K.Unraveling the intricacies of mammalian fertilization[J]. Asian J Androl,2014,16(6):801-802.

[5]SU D,ZHANG W,YANG Y,et al.c.822+126T>G/C:a novel triallelic polymorphism of the TSSK6 gene associated with spermatogenic impairment in a Chinese population[J].Asian J Androl, 2010,12(2):234-239.

[6]JHA K N,WONG L,ZERFAS P M,et al.Identification of a novelHSP70-binding cochaperone criticalto HSP90-mediated activation of small serine/threonine kinase[J].J Biol Chem,2010, 285(45):35180-35187.

[7]LI Y,SOSNIK J,BRASSARD L,et al.Expression and localization of five members of the testis-specific serine kinase(Tssk) family in mouse and human sperm and testis[J].Mol Hum Reprod,2011,17(1):42-56.

[8]WANG P,HUO H L,WANG S Y,et al.Cloning,sequence characterization,andexpressionpatternsofmembersofthe porcine TSSK family[J].Genet Mol Res,2015,14(4):14908-14919.

[9]SINGARAVELU G,RAHIMI S,KRAUCHUNAS A,et al.Forward genetics identifies a requirement for the izumo-like immunoglobulin superfamily spe-45 gene in caenorhabditis elegans fertilization[J].Curr Biol,2015,25(24):3220-3224.

（童颖丹编辑）

Orientation of human Izumo4 and Tssk6 before and after sperm acrosome reaction*

Hao-tian Wu1，Lei Liang2
（1.The Second High School of Huhhot，Huhhot，Inner Mongolia 010010，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Huhhot，Inner Mongolia 010018，China）

Objective To survey Izumo4 and Tssk6 positions before and after sperm acrosome reaction. Methods Anti-mouse polyclonal antibodies were made against Izumo4 and Tssk6 in our laboratory.Using immunohistochemical method，Izumo4 and Tssk6 positions in human sperms were detected before and after the acrosome reaction.Results Before the acrosome reaction，the sperms treated by anti-HIS-Izumo4 polyclonal antibody were stained light in the head above the equator，and a little deeper in the membrane on the equator；those treated by anti-HIS-Tssk6 polyclonal antibody had deep stain in the tail and above the equator. After the acrosome reaction，the acrosome membrane was broken in the sperms treated with ascites containing anti-HIS-Izumo4 and anti-HIS-Tssk6 antibodies and could not be stained by 3-amino-9-ethylcarbazole. Conclusions Tssk6 should be located in acrosome of sperm head and in sperm tail，while Izumo4 is located on the outer membrane of sperm acrosome.

Izumo4；Tssk6

Q78；Q482

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.009

1005-8982（2016）17-0045-04

2016-04-07

内蒙古医科大学青年创新基金（No：YKD2013QNCX029）

梁磊，E-mail：45976953@qq.com；Tel：18904715259