沉默DNA依赖蛋白激酶亚基对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA损伤修复功能的影响*

李大玉，梁大敏，束波，杨加伟，生欣，李长福，余春波，范芳

（遵义医学院生化教研室，贵州遵义563099）

沉默DNA依赖蛋白激酶亚基对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA损伤修复功能的影响*

李大玉，梁大敏，束波，杨加伟，生欣，李长福，余春波，范芳

（遵义医学院生化教研室，贵州遵义563099）

目的探讨DNA依赖蛋白激酶亚基（DNA-PKcs）基因沉默后对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA损伤修复功能的影响。方法采用阳离子脂质体法将shDNA-PKcs干扰质粒转染Bel-7402/5-Fu细胞，根据荧光细胞数计算转染率，实时荧光定量聚合酶链反应（qR T-PCR）及Western blot检测DNA-PKcs的沉默效率；Western blot检测TopoⅡ、γ-H2AX蛋白表达；5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷法检测细胞DNA合成。结果质粒的转染效率为67%；qR T-PCR及Western blot检测结果显示，DNA-PKcs mR NA及蛋白水平的沉默效率分别为82.6%和71.8%；Western blot结果显示，实验组TopoⅡ蛋白表达水平比对照组低，差异有统计学意义（P<0.05），γ-H2AX蛋白表达水平比对照组高，差异有统计学意义（P<0.01）。5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷法结果显示，实验组DNA合成率比对照组低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论shDNA-PKcs干扰质粒能下调Bel-7402/5-Fu细胞中DNA-PKcs、TopoⅡ蛋白的表达，抑制Bel-7402/5-Fu细胞DNA合成。

DNA依赖性蛋白激酶亚基；肝癌耐药细胞/Bel-7402/5-Fu细胞；DNA损伤修复

DNA双链断裂（double-stranded breaks，DSBs），是细胞最严重的一种损伤，可导致细胞失去分裂增殖而死亡，是多数抗癌药物杀死肿瘤细胞的重要机制。DNA依赖蛋白激酶亚基（DNA-dependent ki nase catalytic subunit，DNA-PKcs）是非同源重组修复（nonhomologous end-joining，NHEJ）途径的核心成分，在许多DNA损伤修复途径中扮演着重要角色，如NHEJ、VDJ重组。同时可以磷酸化许多修复基因和转录因子[1-2]。肿瘤耐药与DNA损伤修复能力增强有关[3]，本文将沉默DNA-PKcs的表达，将干扰质粒shDNA-PKcs转染Bel-7402/5-Fu肝癌耐药细胞，检测DNA-PKcs沉默后，对细胞DNA损伤修复功能的影响，以探讨DNA-PKcs在肝癌耐药的发生发展中的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

Bel-7402/5-Fu细胞株购于南京凯基生物科技发展有限公司，PRNAi-U6.1-Neo shRNA质粒购于百奥迈科生物科技有限公司，LipofectamineTM2000 Reagent购于美国Invitrogen公司，DNA-PKcs抗体购于美国Assay biotech公司，TopoⅡ抗体购于英国Abcam公司，γ-H2AX抗体购于美国ABGENT公司，其他试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1细胞培养将Bel-7402/5-Fu细胞放在含有10%的胎牛血清的1640培养液中，置于37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养，每天观察细胞生长状态，取对数期细胞用于实验。

1.2.2分组与转染分为空白对照组、脂质体组、质粒对照组、shDNA-PKcs实验组。细胞接种于6孔板，每孔种5×105个细胞，融合度达到60%～80%时进行转染。配制质粒-脂质体复合物，并加入对应孔中，每孔200μl，4～6h后换液。48h后荧光显微镜下计数，计算转染率（每个视野下的荧光细胞个数/相同视野下的总细胞个数×100%）。

1.2.3实时荧光定量聚合酶链反应检测DNA-PKcs mR NA的表达水平总RNA的提取按TIANGEN公司总RNA提取试剂盒（离心柱型）说明书进行，实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物：DNA-PKcs正向引物5'-GTGACAAGGCAACTGTATGAGC-3'，反向引物3'-TTCTCTAAAAACACCAGCCACA-5'，扩增片段长度163 bp；β-actin正向引物5'-TGACGTGG ACATCCGCAAAG-3'，反向引物3'-GGAGCGACAGG TGGAAGGTC-5'，扩增片段长度206 bp，每个样品DNA-PKcs mRNA表达量经qRT-PCR检测，PCR产物作熔解曲线分析，根据公式2-△△CT相对定量分析计算DNA-PKcs mRNA相对表达量。

1.2.4Western blot检测DNA-PKcs、TopoII、γ-H2AX蛋白表达提取各组细胞总蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯法定量样品蛋白含量。Western blot法检测DNA-PKcs、TopoII、γ-H2AX蛋白在各组中的表达。

1.2.5EdU法检测细胞DNA合成率细胞处理48 h后，按照广州锐博5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）检测试剂盒操作说明书进行操作，荧光显微镜下观察细胞，拍照。由绿光激发蓝色荧光，由紫光激发红色荧光。每组取5个视野，计数相同视野下EdU标记细胞及总细胞数，计算DNA合成率。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析和LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1shDNA-PKcs质粒的转染效率

shDNA-PKcs质粒转染效率约为67%。见图1。

图1　shDNA-PKcs质粒转染效率

2.2DNA-PKcs mRNA的表达水平

各组DNA-PKcs mRNA水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=74.404，P=0.000）。各组DNA-PKcs相对倍数变化比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=160.518，P=0.000）。shDNAPKcs实验组与空白对照组DNA-PKcs mRNA水平比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=2.919，P= 0.004），shDNA-PKcs实验组mRNA水平高于空白对照组；shDNA-PKcs实验组与空白对照组DNA-PKcs相对倍数变化比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t= 17.237，P=0.001），即shDNA-PKcs实验组DNA-PKcs mRNA相对表达量低于空白对照组。DNA-PKcs mRNA水平的沉默效率为82.6%。见附表和图2。

附表各组DNA-PKcs mRNA相对表达量比较（n=3±s）

注：†与对照组比较，P<0.01

DNA-PKcs相对倍数空白对照组23.133±0.16417.207±0.3371.000±0.000脂质体组22.493±0.13516.630±0.4781.045±0.101质粒对照组22.680±0.27417.047±0.6901.226±0.052 shDNA-PKcs实验组26.013±0.562†17.537±0.4680.174±0.083†F值74.404160.518 P值0.0000.000组别DNA-PKcs mRNA β-actin mRNA

2.3DNA-PKcs、TopoII、γ-H2AX的蛋白表达水平

各组DNA-PKcs、TopoⅡ、γ-H2AX蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（DNA-PKcs：F=23.478，P=0.000；TopoⅡ：P=15.564，P=0.001；γ-H2AX：F=157.096，P=0.000）。shDNAPKcs实验组DNA-PKcs、TopoⅡ、γ-H2AX蛋白相对表达量与对照组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（DNA-PKcs：t=8.407，P=0.006；TopoⅡ：t= 5.225，P=0.017；t=12.348，P=0.003），表明shDNAPKcs实验组DNA-PKcs、TopoⅡ蛋白相对表达量低于空白对照组，γ-H2AX蛋白相对表达量高于空白对照组。DNA-PKcs蛋白水平的沉默效率为71.8%。见图3。

2.4DNA合成率

各组DNA合成率，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=49.296，P=0.000），而shDNA-PKcs实验组DNA合成率与空白对照组比较，经LSD-t检验，差异具有统计学意义（t=12.290，P=0.003），即shDNA-PKcs实验组DNA合成率低于空白对照组。可见DNA-PKcs的沉默可降低肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA的合成。见图4。

图4　各组DNA合成率比较

3 讨论

肝癌是临床常见的恶性肿瘤，目前临床常用手术结合放疗和化疗。但长期放疗和化疗后，容易出现耐药，这可能与DNA损伤信号紊乱和DNA损伤修复有关[4-5]。很多因素均会引起DNA损伤。其中，由电离辐射、抗癌药物（如阿霉素）等引起的DNA双链断裂是最严重的损伤。在哺乳动物细胞中，以DNA依赖蛋白酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）为核心组件的NHEJ途径，在DNA双链断裂的修复中有着非常重要的作用[6-7]。

DNA-PKcs是DNA-PK的催化亚单位，位于染色体8ql1，由4 128个氨基酸组成的大分子量蛋白质，相对分子量为470 kD，主要包括DNA断裂结合区、催化功能区、Ku结合区3个功能区，属于胞内磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K）家族。DNA双链断裂后，DNA-PKcs结合到DNA断裂末端，通过自身磷酸化，以及磷酸化下游蛋白，如Artemis、DNA ligase4、XRCC4和Cernunnos等完成DNA损伤修复[8-9]。DNA-PKcs能维持基因组的稳定性，具有肿瘤抑制功能[10]。目前有研究[11]表明，下调DNA-PKcs表达能增加肿瘤细胞对药物的敏感性。有研究显示，在耐药的神经胶质瘤、口腔癌的放疗患者中，发现DNA-PKcs表达量增加[12]，表明放疗和化疗后，机体产生了耐药性。另外，在一些耐药细胞中发现DNA-PKcs表达和活性增加[13-14]。本实验已通过沉默DNA-PKcs发现耐药蛋白P-gp表达降低，因此推测耐药细胞Bel-7402/5-Fu耐药性降低可能与DNA-PKcs沉默所致的P-gp下调有关。可能原因是DNA-PKcs介入到耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA损伤修复系统所致。DNA-PKcs在某些耐药细胞中表达增加和活性增强，提高了耐药细胞DNA损伤修复的能力，从而对抗化疗药物所致的DNA损伤而引起耐药。本实验采用RNAi技术沉默DNA-PKcs，检测肝癌耐药细胞中γ-H2AX的表达情况。结果发现，沉默后肝癌耐药细胞中γ-H2AX明显增加，说明DNA-PKcs沉默后能够增加DNA的损伤。为了进一步说明沉默DNA-PKcs后能增加DNA的损伤情况，本实验还检测沉默后DNA的合成情况和TopoⅡ蛋白的表达情况，结果发现沉默后DNA合成降低，TopoⅡ表达也降低。以此可以推测沉默DNAPKcs后能增加DNA损伤，降低DNA损伤修复功能。可能是DNA-PK为核心的NHEJ途径在肝癌耐药细胞DNA损伤修复中有着重要的作用，DNA-PKcs是否还通过其他机制调节肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA损伤修复功能，还有待进一步实验研究。

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（申海菊编辑）

Effects of DNA-PKcs gene silence on repair of damaged DNA in multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell line Bel7402/5-Fu*

Da-yu Li，Da-min Liang，Bo Shu，Jia-wei Yang，Xin Sheng，Chang-fu Li，Chun-bo Yu，Fang Fan

（Department of Biochemistry，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563099，China）

Objective To investigate the effect of shDNA-PKcs on DNA damage repair function of the multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell line Bel7402/5-Fu.Methods shDNA-PKcs plasmids were transiently transfected into Bel7402/5-Fu cells via cathodolyte liposome transfection method.Transfection efficiency was evaluated by calculating the fluorescent cells and silence efficiency was determined using qRTPCR and Western blot.qRT-PCR and Western blot were used to detect mRNA and protein expressions of TopoⅡand γ-H2AX.The cellular DNA synthesis was detected by 5-ethynyl-2'-deoxyuridine（EdU）.Results Transfection efficiency was 67%.qRT-PCR and Western blot results showed the efficiency of RNA and protein interference for DNA-PKcs was 82.6%and 71.8%.Western blot analysis showed that the protein expression of TopoⅡin the shDNA-PKcs group was significantly lower than that in the control group（P＜0.05），while γ-H2AX expression was higher than that of the control group（P＜0.01）.EdU detection results showed the DNA synthesis of the shDNA-PKcs group decreased compared with that of the control group（P＜0.05）. Conclusions shDNA PKcs interference plasmid can down-regulate the expressions of DNA-PKcs and TopoⅡand inhibit the DNA synthesis of Bel7402/5-Fu cells.

DNA-PKcs；Bel7402/5-Fu cell；DNA damage repair

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.004

1005-8982（2016）17-0019-04

2015-10-30

贵州省社发攻关项目（No：[2009]3066）；贵州省社发攻关项目[黔科合SY（2013）3008]

范芳，E-mail：fanf1970@126.com