百里香多糖提取工艺及抗氧化性研究

郑 张，翟华涛，卢 溶，丁建云，马小荣，蒙晓娴，张 艳，林 艳，李舂龙

（北方民族大学化学与化学工程学院，宁夏 银川 750021）

百里香多糖提取工艺及抗氧化性研究

郑 张，翟华涛，卢 溶，丁建云，马小荣，蒙晓娴，张 艳，林 艳，李舂龙

（北方民族大学化学与化学工程学院，宁夏 银川 750021）

以百里香为原料提取多糖，多糖的含量采用硫酸-苯酚法测定。通过单因素法和正交实验的方法确定百里香多糖的最佳提取条件。单因素分别选取了时间、温度、物料比，确定了对百里香多糖提取的最优单因素条件，进行了正交实验，确定了综合因素。确定利用弱酸弱碱进行提取优化，再提取纯化多糖，进行抗氧化性研究。

百里香；多糖；提取

随着经济的发展，中国人的生活水平有了很大的改善，但是疾病也随之增加，因此人们对于自身健康的重视程度愈加强烈。天然植物中的某些具有活性的物质具有很好的治疗、预防疾病的效果，这给我国的中草药市场带来了前所未有的机遇。

植物多糖，有一部分是没有活性的，而有一小部分通过糖苷键链接小分子蛋白质的是具有活性的（分别为氧苷、硫苷、氮苷、碳苷）。20世纪60年代初期，研究者逐渐发现多糖类的活性物质有多方面的生理活性。最初知道多糖对肿瘤、心血管疾病和抗衰老具有少量的疗效作用，后来，大量的实验研究结果表明，多糖类主要作用于网状内皮系统，影响免疫系统，并且还会影响核酸、蛋白质的合成，以及对于抗体的生成有一定的促进作用。因此多糖类的有效成分能非特异性地提高人体的免疫功能，实现了用作免疫增强药的可能。

百里香，属唇形科多年生半罐木草本植物，分布于我国的河北、内蒙、山西、陕西、甘肃、青海、宁夏等地，资源较为丰富。有研究者用生物阻抗法测定了百里香植物挥发油的抗氧化活性［1］。本研究以宁夏固原张易镇地椒草为原料，使用硫酸-苯酚法测量多糖的含量［2-3］，探究时间、温度对百里香多糖提取的影响，并分别使用弱酸（柠檬酸、乙酸）和弱碱（碳酸氢钠）及乙醇，进行提取结果的优化，以期为百里香多糖的生产提供部分依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

HH-6数显恒温水浴锅，XFB-500高速中药粉碎机，YP3102电子天平，722S可见分光光度计，SHB-ⅢA循环水式多用真空泵。

1.2 试剂

地椒草：宁夏固原张易镇提供，在实验室粉碎磨粉，全粉过0.175mm筛。

葡萄糖、浓硫酸、苯酚、碳酸氢钠、乙醇、柠檬酸、乙酸均为分析纯。

2 实验步骤

2.1 原料的制备

用粉碎机将百里香粉碎，过0.175mm筛，放置备用。

2.2 葡萄糖标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于试管中备用，并且分别补充去离子水至2.0mL，精密加入新制5%苯酚溶液1mL，摇匀后，马上精密量取浓硫酸5mL，摇匀，放置40min，以相对应的试剂为空白组，利用紫外-可见分光光度计（已经预热），设置490nm的波长测定对照品的吸光度，

图1 葡萄糖标准曲线

2.3 提取实验

2.3.1 提取时间

取0.6g百里香用60mL去离子水提取，温度为45℃。分别在10min、20min、30min、40min、50min、60min条件下提取，用硫酸苯酚法测定多糖含量。实验结果见图2。随着时间逐渐增加，溶液的吸光度不断上升，但是在40min后下降，说明多糖在40min左右，提取率是最高的。

图2 提取时间对百里香多糖的影响

2.3.2 提取温度

取0.6g百里香用60mL去离子水提取，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃条件下提取10min，测量多糖含量，结果见图3。随着温度的增加，溶液的吸光度不断上升，但是在40℃之后，多糖得率下降，说明多糖在40℃左右提取率是最高的。

2.3.3 料液比

取0.5、0.6、0.7g的百里香，在25℃、40min条件下进行提取，测量多糖含量，结果见图4。随着百里香的不断加入，吸光度逐渐增大，在料液比为0.7的条件下最大。

图3 温度对百里香多糖的影响

图4 料液比对百里香多糖的影响

3.3 正交实验

根据以上单因素实验，确定去离子水提取的正交试验的因素和水平表如表1所示。根据选择的因素和水平做正交试验，结果见表2。

表1 正交试验因素及水平设计

表2 正交试验结果

由正交实验结果分析可知，当浸提时间为45min，浸提温度45℃，料液比为0.7时，多糖提取量最大。并且根据R值可知影响大小为料液比＞提取温度＞提取时间。

3 实验优化

3.1 使用碳酸氢钠

在40℃、40min下，称取0.6g百里香，以1mL为单位加入碳酸氢钠饱和溶液，测量碳酸氢钠用量分别为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL时的多糖含量，结果见图5。

图5 碳酸氢钠用量对百里香多糖的影响

由图5可知，随着碳酸氢钠的加入量增加，多糖的得率并没有很大的变化，说明碳酸氢钠的加入量对多糖的提取无影响，但是与其他的优化条件相比，得率最高，有可能是碳酸氢钠与细胞壁结合，改变了细胞的整体结构，没有传质阻力，使得多糖得率最高。但是与去离子水的最优结果比较，可知去离子水体系多糖得率高，因此不是最优提取体系。

3.2 使用乙酸

在40℃、40min条件下，称取0.6g百里香，以1mL为单位加入乙酸，测量乙酸用量分别为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL时的多糖含量，结果见图6。

图6 乙酸用量对百里香多糖的影响

由图6可知，乙酸用量在4mL的时候效果最好，与只有去离子水的体系结果比较可知，提取效果比去离子水的效果好。因此可以推出，使用乙酸可以提高多糖的得率，因为乙酸具有一定的极性，有助于多糖的提取，是最优体系。

3.3 使用乙醇

在40℃、40min条件下，称取0.6g百里香，以1mL为单位加入乙醇，测量乙醇用量分别为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL时的多糖含量，结果见图7。

图7 乙醇用量对百里香多糖的影响

由图7可知，1mL、2mL、3mL的乙醇用量效果相差不大，相对于4mL、5mL、6mL的效果要好，但是没有去离子水的效果好。因此乙醇提取不是最优体系。

3.4 使用柠檬酸

在40℃、40min条件下，称取0.6g百里香，以1mL为单位加入柠檬酸，测量柠檬酸用量分别为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL时的多糖含量。用同一种方法测定时，加入1mL、2mL的柠檬酸，吸光度为0.153和0.340，可以推断出效果不理想。

4 实验结果及产率计算

4.1 实验结果

多糖含量及多糖提取率分别按下面两个公式进行计算。

其中， 0.9为葡萄糖换算成多糖的系数。

在温度、时间的单因素实验中，在40℃、40min、料液比0.7的条件下，多糖的提取率是最高的，分别是5.27%、5.89%、5.20%。在正交实验中R值越大，对百里香多糖提取率的影响就越大，所以各因素对地椒草提取的影响大小为料液比＞提取温度＞提取时间，通过正交实验选取45min、45℃、物料比0.7为最优结果。

4.2 实验结果验证

为了验证正交实验结果的准确性，在正交实验的最优结果下进行百里香多糖提取的验证试验，重复3次，多糖提取率分别为5.83%、5.77%、5.93%，平均提取率为5.84%，说明优化条件的可行性和重现性较好，工艺稳定，适合用于百里香多糖的提取。

5 纯化多糖及抗氧性研究

5.1 纯化多糖

将用乙醇脱脂，在80℃、1h的条件下处理后的百里香0.6g，加入60mL去离子水，在40℃、40min的条件下提取，得滤液，冷却至室温，加入乙醇至50%的体系，放置冰箱，静置一夜，抽滤，再加入乙醇至70%的体系，放置冰箱，静置一夜，抽滤，取滤液，用丙酮与滤液（4∶1）充分震荡，静置，取下层液，浓缩干燥，得多糖［4］。

5.2 抗氧化性研究

Fenton反应可以产生·OH自由基，在体系中，加入水杨酸（水杨酸可以结合·OH），产生有色物质，该物质在510nm下具有最大吸收峰。加入多糖后，则多糖会与·OH竞争水杨酸，导致吸光度下降［5］。

取纯化后的多糖，分别配成浓度为0.1mg·mL-1、0.2mg·mL-1、0.3mg·mL-1的溶液待用。反应体系中含 9mmol·L-1的水杨酸溶液、9mmol·L-1的FeSO4溶液及不同浓度的多糖溶液，水浴加热至37℃，再加入8.8mmol·L-1的双氧水1mL，启动整个反应。在不同时间（10min、20min、30min、40min）取适量溶液进行吸光度测量，结果如图8所示。可知在25min时，反应停止，吸光度在10～25min是下降的，并且趋势明显，在25min后，吸光度不变，说明反应停止。

6 结论

本实验采用传统的热水提取，测定了时间、温度、料液比对百里香多糖提取的影响。通过正交实验优化了最佳工艺条件，在浸提时间45min、浸提温度45℃、料液比为0.7时提取效率是最大的，同时，使用弱酸、弱碱对百里香多糖提取进行优化实验研究。通过优化提取体系，可以增加多糖的提取率，为以后百里香多糖工业化生产提供依据。

图8 抗氧化性研究

百里香多糖具有抗氧化能力，但是由于是体外进行的实验，没有从人体生理方面进行研究，百里香多糖的体内生物功效仍有待研究［6］。另外对于百里香多糖的生理功能可以结合药剂学来分析，对于其多糖结构可以将其糖链断开，考虑多糖上面的小分子蛋白，将其制成皮上吸收剂，也可以制成栓剂，这种使用方式是对天然药物使用的一种革新。

［1］ 丁骁.百里香提取物抗油脂氧化活性研究［J］.粮油加工与食品机械，2004（4）：37-39.

［2］ 陈群，刘家昌.人参多糖、黄芪多糖、枸杞多糖的研究进展［J］.淮南师范学院学报，2001 （1）：39-41.

［3］ 徐晓飞，陈健.多糖含量测定的研究进展［J］.食品科学，2009，30（20）：443-448.

［4］ 张颖，潘俊羽.枇杷叶多糖水提醇沉法的提取条件优化［J］.贵州农业科学，2014，42（6）：161-163.

［5］ 马超，刘杰凤，周天，等.黄皮果多糖提取工艺优化及抗氧化性研究［J］.江苏农业科学，2013，41（8）：290-292.

［6］ 刘航，国旭丹，马雨洁，等.超声波辅助提取苦荞麦多糖工艺优化及其体外抗氧化研究［J］.食品科学，2013，34（14）：45-50.

Extraction and Optimization of Polysaccharide fromThyme and its Antioxidant Research

ZHENG Zhang， ZHAI Hua-tao， LU Rong， DING Jian-yun， MA Xiao-rong， MENG Xiao-xian， ZHANG Yan，LIN Yan， LI Chong-long
（School of Chemistry and Chemical Engineering， Beifang University of Nationalities， Yinchuan 750021， China）

Polysaccharide was extracted from thyme， and then was determined by sulfuric acid-phenol method.The optimum extraction conditions were obtained by single factor method and orthogonal test.Time， temperature and material ratio was selected as single factor， the optimal single factor of extraction was determined.The orthogonal test was carried out and the composite factors were obtained.Polysaccharide was extracted from thyme with weak acid and weak base.After purification， the antioxidant research of polysaccharide was carried out.

thyme； polysaccharides； extraction

R 284.2

A

1671-9905（2016）09-0014-04

2015年国家级大学生创新创业训练计划项目（201511407009）

李舂龙，硕士，助理研究员，主要从事小分子化合物的合成及化学工艺研究，电话：09512068121，E-mail：lililong0@126.com

2016-07-01并且分别用浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，测定并且绘制出标准品的吸光度曲线，结果见图1。