KLF4基因沉默对大鼠肝星状细胞HSC-T6胶原代谢的影响及机制研究

李涛　牛丽娟　刘文宣　杨磊　李曼　曹丹丹　彭乱顺



·论著·

KLF4基因沉默对大鼠肝星状细胞HSC-T6胶原代谢的影响及机制研究

李涛牛丽娟刘文宣杨磊李曼曹丹丹彭乱顺

目的探讨大鼠KLF4基因沉默，对大鼠肝星状细胞HSC-T6胶原代谢的影响及其机制。方法设计并构建针对大鼠KLF4基因的3个干扰质粒(pGPU6-1，pGPU6-2，pGPU6-3)以及阴性对照。采用实时荧光定量RT- PCR(Real-time RT- PCR )和western blot的方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表达情况，筛选出沉默最好的干扰质粒,将筛选出来的干扰质粒pGPU6-3，转染大鼠HSC-T6细胞。转染24 h和48 h后分别采用Real-time RT-PCR法和western blot的方法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA和蛋白的表达。Real-time RT-PCR法以GAPDH为内参照，用2-ΔΔCt法进行分析计算。western blot的方法以β-actin蛋白为内参照，进行分析。结果Real-time RT- PCR结果显示，pGPU6-3转染大鼠HSC-T6细胞后，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TIMP-1相对于对照组的mRNA表达分别下降为0.358±0.038，0.298±0.041和0.478±0.048； 而MMP-13 mRNA的表达则上升为1.712±0.034。Western Blot检测中，pGPU6-3转染大鼠HSC-T6细胞后，以β-actin为内参照，Ⅰ型胶原蛋白，Ⅲ型胶原蛋白和TIMP-1蛋白的表达分别下降为0.326±0.051，0.283±0.074和0.331±0.039；而MMP-13蛋白的表达则上升为1.273±0.038。结论KLF4基因沉默可以显著减少大鼠HSC-T6细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达，其机制与增加MMP-13表达，而抑制TIMP-1的表达有关。

人肝星状细胞；KLF4；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原；MMP-13

肝纤维化的本质是由于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成与降解不平衡所导致ECM的过度沉积。正常肝脏中ECM的主要成份是Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ，Col Ⅰ)和Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ，Col Ⅲ)，其他胶原所占比例较少[1]。而肝星状细胞(hepatic stellate cells， HSCs) 是肝脏中的ECM的主要合成细胞，同时，HSCs还能分泌多种胶原酶和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)以降解ECM，同时分泌基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)防止胶原过度降解，使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中[2]。KLF4是Krüppel样因子(Krüppel-like factors，KLFs)家族的重要成员，具有调节某些细胞的增殖、分化以及凋亡等重要功能[3]。那么，KLF4基因沉默是否会对HSCs的胶原的代谢产生影响？本研究将筛选出沉默效果最好的干扰质粒，转染大鼠HSC-T6细胞，观察KLF4沉默是否可以对HSCs的胶原代谢及其相关酶类产生影响。

1　材料与方法

1.1主要试剂大鼠肝星状细胞HSC-T6购自中南大学湘雅医院细胞中心；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素购自美国GIBCO公司；Liprofectamine 2000、Trizol reagent购自美国Invitrogen公司；SYBR Green Real-Time试剂盒购自北京百泰克公司；M-mlV Reverse Transcriptase试剂盒购自美国GeneCopoeia公司；无内毒素质粒大提试剂盒 购自北京天根公司；兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗体购自美国abcam公司；兔抗大鼠MMP-13、兔抗大鼠Ⅰ型胶原多克隆抗体购自美国GeneTex公司、兔抗大鼠Ⅲ型胶原多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗大鼠KLF4、β-actin单克隆抗体购自美国epitomics公司；IRDye800 Anti-Rabbit IgG购自美国Rockland公司。

1.2方法

1.2.1参考Genbank中的大鼠KLF4的基因序列，依据siRNA设计原则，分别设计3对siRNA序列，使用BLAST将选定的序列和相应的大鼠基因组数据库进行比较，排除与其他编码序列同源的序列。同时，设计一条阴性对照dsRNA。利用含U6启动子的pGPU6/GFP/Neo表达质粒，构建其RNA干扰重组体。交由上海吉玛制药技术有限公司构建。干扰质粒pGPU6-1靶序列：GGACCTAGACTTTATCCTTTC；干扰质粒pGPU6-2靶序列：GGTCATCAGTGTTAGCAAAGG；干扰质粒pGPU6-3靶序列：GGAACTCTCTCACATGAAGCG；干扰质粒pGPU6阴性对照靶序列: GTTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.2.2细胞培养:在37℃，5% CO2培养箱中，用含12%胎牛血清的DMEM培养基常规培养HSC-T6细胞。当细胞生长至合适汇合度时用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养，待细胞处于对数生长期时用于实验。

1.2.3干扰质粒瞬时转染大鼠HSC-T6细胞:用天根公司质粒抽提试剂盒将构建好的干扰载体重组质粒从保存菌DH5a中抽提出来，根据试剂说明，转染前1 d将细胞接种至6孔板，在转染前6 h更换为无抗生素的Opti-MEM培养基，至70%汇合度时转染。根据lipofectamine 2000的Protocol分别配置A, B液，溶液A:用Opti-MEM培养基稀释干扰质粒到总体积50 μl。溶液B:用Opti-MEM培养基稀释4 μl脂质体到总体积50 μl，室温孵育5 min。混合溶液A和B，室温孵育20 min，将100 μl脂质体/DNA混合物加入6孔培养板内，置于5% CO2，37℃培养箱孵育6 h，然后更换为2 ml含10%小牛血清的新鲜DMEM生长培养基。于转染后24 h和48 h提取RNA和蛋白进行检测。

1.2.4Real time RT-PCR检测HSC-T6中KLF4、Col Ⅰ、Col Ⅲ、MMP-13、TIMP-1mRNA的表达转染干扰质粒24 h后用PBS清洗细胞，每孔加入1 ml Trizol，充分裂解，将裂解液转至EP管中，加入200 μl氯仿；4℃，12 000 r/min离心15 min，把上层无色液相移入新的EP管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置30 min；4℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清；加入1 ml 75%乙醇，洗涤沉淀；4℃，5 000 r/min离心3 min，倒出液体；室温晾干，加入DEPC水20 μl溶解。将细胞总RNA 2 μg，采用M-mlV Reverse Transcriptase试剂盒进行反转录，使用SYBR Green Real-Time试剂盒，对反转录所获得的cDNA进行Real time RT-PCR检测，选取2 μl cDNA于20 μl反应体系中进行反应，反应在Rotor-GeneTM6000(Corbett)中进行，循环条件为94℃ 5 min，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s共35个循环。以GAPDH作为内参基因，采用Primer3.0软件，设计所需片段的扩增引物，由华大基因公司合成与纯化，序列如下: 大鼠KLF4上游引物序列：5’-GAACTGACCAGGCACTACCG-3’下游引物序列：5’-CTTGCTGGGAACTTGACCAT-3’；大鼠Col Ⅰ上游引物序列：5’- ATCTTTCTCCACGTTCGCGT-3’下游引物序列：5’- GGAAGTCGCTTCATGTGGGA-3’；大鼠Col III上游引物序列：5’- TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3’下游引物序列：5’- CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3’；大鼠MMP-13上游引物序列：5’-AGGAGCATGGCGACTTCTAC-3’下游引物序列：5’-AGACCTAAGGAGTGGCCGAA-3’；大鼠TIMP-1上游引物序列：5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3’下游引物序列：5’-CCATTTGATGTTAGCGGGAT-3’；大鼠GAPDH上游引物序列：5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3’下游引物序列：5’-CCATTTGATGTTAGCGGGAT-3’，每个样本重复三次，取平均值为Ct值，用仪器自带软件进行荧光定量分析，计算出△Ct值，采用相对定量2-ΔΔCt法比较目的基因mRNA的表达变化。

1.2.5Western blot法检测HSC-T6中KLF4、Col Ⅰ、Col Ⅲ、MMP-13、TIMP-1及对照β-actin蛋白表达:转染干扰质粒 48 h后用PBS清洗细胞，加入适量RIPA裂解液，用细胞刮收获细胞裂解物，移入EP管；离心，12 000 g,15 min，取上清液加入2×loading buffer，100℃煮沸5 min，取上清待用。取细胞总蛋白80 μg，经10% SDS-PAGE凝胶120V电压进行电泳分离，之后电转移至PVDF膜上，将PVDF膜置于5%脱脂奶粉(0.05%TBST配制)中封闭1 h，分别加入兔抗大鼠KLF4 (1∶500稀释)，兔抗大鼠TIMP-1(1∶1 000稀释)，兔抗大鼠MMP-13(1∶1 000稀释)、兔抗大鼠Col Ⅰ(1∶1 500稀释)、兔抗大鼠Col Ⅲ(1∶500稀释)、兔抗大鼠β-actin(1∶3 000稀释)孵育PVDF膜，4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。利用TBS配制的红外染料标记的二抗 IRDye800 Anti-Rabbit IgG (1∶15 000 稀释)孵育PVDF膜，室温1 h。TBS洗膜3次，每次10 min。利用Odyssey扫描仪对PVDF膜进行扫描显影并保存图像。

2　结果

2.1干扰质粒对HSC-T6细胞KLF4的沉默效果3种干扰质粒(pGPU6-1，pGPU6-2，pGPU6-3)以及阴性对照分别转染HSC-T6细胞24 h后，应用Real-time RT-PCR检测HSC-T6中KLF4的mRNA表达情况。应用2-ΔΔCt法结果显示，pGPU6-1组、pGPU6-2组和pGPU6-3组相对于对照组的KLF4 mRNA的表达分别是0.601±0.043，0.548±0.051和0.282±0.027(P<0.05)。可见，pGPU6-3组对KLF4 mRNA的沉默效果最好。3种干扰质粒转染HSC-T6细胞后48h，应用western blot法检测HSC-T6中KLF4的蛋白表达情况。与内参蛋白β-actin相比， pGPU6-1组，pGPU6-2组和pGPU6-3组KLF4 蛋白表达分别是0.513±0.032，0.475±0.042和0.305±0.035(P<0.05)。与mRNA的结果类似，pGPU6-3组对KLF4 蛋白的沉默效果最好。故后续试验均采用干扰质粒pGPU6-3沉默KLF4的表达。见表1，图1。

2.2Real time RT-PCR检测HSC-T6中Col、Col Ⅲ、

组别KLF4mRNA(2-ΔΔCt)KLF4蛋白(protein/β-actin)对照组1.008±0.0220.901±0.028pGPU6-10.601±0.043*0.513±0.032*pGPU6-20.548±0.051*0.475±0.042*pGPU6-30.282±0.027*0.305±0.035*

注：与对照组比较，*P<0.05

图1western blot检测转染三种干扰质粒 48 h后HSC-T6中KLF4的蛋白表达结果

mRNA以及western blot技术检测相应蛋白的表达 干扰质粒pGPU6-3转染HSC-T6细胞后24h，应用Real time RT-PCR检测HSC-T6中Col Ⅰ、Col Ⅲ的mRNA表达情况。以Control组为对照组，Col Ⅰ、Col Ⅲ相对于Control组的mRNA的表达分别是0.358 ±0.038，0.298±0.041(P<0.05)。与mRNA的结果类似，pGPU6-3转染HSC-T6细胞后48 h，应用western blot法检测HSC-T6中Col Ⅰ、Col Ⅲ的蛋白表达情况。以β-actin为内参照，Col Ⅰ，Col Ⅲ型胶原蛋白的表达分别下降为0.326±0.051和0.283±0.074(P<0.05)。见表2，图2。

组别ColⅠmRNAlevel(2-ΔΔCt)ColⅠ蛋白(protein/β-actin)ColⅢmRNAlevel(2-ΔΔCt)ColⅢ蛋白(protein/β-actin)对照组1.007±0.0130.998±0.0121.003±0.0120.995±0.023pGPU6-30.358±0.038*0.326±0.051*0.298±0.041*0.283±0.074*

注：与对照组比较，*P<0.05

2.3Real time RT-PCR检测HSCs中MMP-1、TIMP-1、MMP-13 mRNA以及Western blot技术检测相应蛋白的表达。pGPU6-3转染HSC-LX2细胞后24h，应用Real time RT-PCR检测HSC-T6中MMP-13、TIMP-1的mRNA表达情况。应用2-ΔΔCt法结果显示，以Control组为对照组，MMP-13、TIMP-1相对于Control组的mRNA的表达分别是1.712 ±0.034，0.478±0.048(P<0.05)见表3。与mRNA的结果类似，pGPU6-3转染HSC-T6细胞后48 h，应用western blot法检测HSC-T6中MMP-1、TIMP-1的蛋白表达情况，以β-actin为内参照，则MMP-1蛋白表达上升为1.273±0.038，而TIMP-1蛋白的表达下降为0.331±0.039(P<0.05)见表3，图3。

图2western blot检测转染pGPU6-3 48h后HSC-T6中ColI I、ColI III蛋白的表达结果

图3western blot检测转染pGPU6-3 48h后HSC-T6中MMP-13、TIMP-1蛋白的表达

组别MMP-13mRNAlevel(2-ΔΔCt)MMP-13proteinlevel(protein/β-actin)TIMP-1mRNAlevel(2-ΔΔCt)TIMP-1proteinlevel(protein/β-actin)对照组0.991±0.0130.812±0.0411.005±0.0170.791±0.044pGPU6-31.712±0.034*1.273±0.038*0.478±0.048*0.331±0.039*

注：与对照组比较，*P<0.05

3　讨论

肝纤维化过程中，一个重要的特征就是新合成的ECM增加速度超过了ECM的降解速度。实际上，肝纤维化的本质就是由于 ECM合成与降解不平衡所导致ECM的过度沉积[1]。正常肝脏中ECM的主要成份是Col Ⅰ和Col Ⅲ，且以Col I的增加为主，Col Ⅰ的含量可以达到60%～70%，其他胶原所占比例较少。另外也包含一些非胶原成分，例如纤连蛋白，层连蛋白等成分[4]。这些ECM不断地被基质降解蛋白酶类分解，维持动态的平衡。肝星状细胞HSCs是正常及纤维化肝脏中的ECM的主要合成细胞，其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上[5]。同时，HSCs还能够分泌多种酶类来调节ECM的代谢。这些蛋白酶中最重要的是MMP。MMP能够降解除多糖外的所有ECM。按其结构和功能的差异，MMP共可分为四类[6]：第一类是间质胶原酶(MMP-1，MMP-13等)，主要水解Col Ⅰ和Col Ⅲ等纤维类胶原，在维持ECM的平衡中起着关键作用；第二类是明胶酶(MMP-2，MMP-9)，主要水解明胶蛋白和变性胶原蛋白；第三类是基质水解酶(MMP-3，MMP-10等)，主要水解糖蛋白和Col IV等。第四类是基膜型酶(MMP-7，MMP-12，MMP-12等)，具有激活其他MMP的作用。MMP的活性受三个水平的调节，即转录水平、胶原激活以及基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)的调节。TIMP家族共有四个成员TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4，而肝脏中只有TIMP-1和TIMP-2，且TIMP-1 活力最强。TIMPs以1∶1的比例与MMPs形成高亲和力复合物，抑制MMPs的活性,从而增加ECM的沉积[7]。研究表明，在大鼠肝纤维化自发恢复的模型中，MMP-13的表达水平是升高的，而TIMP-1的表达水平是逐渐下降的。相反，研究发现如果提高TIMP-1的表达，减少MMP-13的表达，可以使大鼠的纤维化程度加深[8]。所以，如何在纤维化的肝脏中增加MMP-1以及大鼠中的MMP-13的表达，或者减少TIMP-1的表达，来减少肝纤维化中胶原的产生，减轻肝纤维化，已经成为肝纤维化研究中的热点问题。例如，Hu等采用腺病毒载体将针对纤溶酶原激活物抑制剂-1基因的shRNA转导入纤维化大鼠体内，发现与对照组相比，肝纤维化程度明显减轻。进一步研究发现其作用机制可能是通过上调MMP-13水平，而下调TIMP-1水平[9]。Ozaki等将肝细胞生长因子加入人HSC-LI90细胞中，发现ColI表达量明显减少，其机制可能是由于MMP-1表达量增加，促进了胶原的降解[10]。

与上述研究类似，因为KLF4是Krüppel样因子(Krüppel-like factors，KLFs)家族的重要成员，具有调节某些细胞的增殖、分化以及凋亡等重要功能[3]，故本研究设计合成了针对大鼠靶向KLF4的RNA干扰质粒载体，并筛选出沉默效果最好的干扰质粒载体，通过沉默KLF4表达，使大鼠HSC-T6细胞的Col I和ColIII的表达明显下降，同时MMP-13的表达增高以及TIMP-1的表达下调。综上所述，KLF4是通过上调MMP-13以及下调TIMP-1的表达来调节HSC-T6的胶原合成与代谢，降低了肝纤维化的程度，为肝纤维化的防治提供了新的研究方向。

1Lade A, Noon LA, Friedman SL. Contributions of metabolic dysregulation and inflammation to nonalcoholic steatohepatitis, hepatic fibrosis, and cancer.Curr Opin Oncol,2014,26:100-107.

2Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Hepatic Stellate Cells and Liver Fibrosis.Compr Physiol,2013,3:1473-1492.

3Wang C,Han M,Zhao XM, et al. Krüppel-like factor 4 is required for the expression of vascular smooth muscle cell differentiation marker genes induced by all-trans retinoic acid. J Biochem,2008,144: 313-321.

4Bittnerová1 L, Jiroutová1 A, Rudolf E, et al. Effect of collagen I gel on apoptosis of rat hepatic stellate cells. Acta Medica,2013,56: 73-79.

5Kordes C, Sawitza I, Götze S, et al. Hepatic stellate cells contribute to progenitor cells and liver regeneration. J Clin Invest,2014,124:5503-5515.

6Murphy FR, Issa R, Zhou X, et al. Inhibition of apoptosis activated hep atic stellate cells by tissue inhibitor of metalloproteinase-1 is mediated via effects on matrix metalloproteinase inhibition: implications for reversibility of liver fibrosis.J Biol Chem,2002,277:11069-11076.

7Hasegawa-Baba Y, Doi K. Changes in TIMP-1 and -2 expression in the early stage of porcine sennn-indncedliver fibrosis in rats.Exp Toxicol Patbol,2011,63 :357-361.

8Yoshiji H， Kuriyanta S， Miyamoto Y，et al.Tissuc inhibitor mctalloprotcinasc-1 promotes liver fibrosis development a transonic mouse model.Hepatology 2000,32:1248-1254.

9Hu PF, Chen H, Zhong W, et al. Adenovirus-mediated Transfer of siRNA against PAI-1 mRNA ameliorates hepatie fibrosis in rats. Journal of Hepatology,2009，51:102-113.

10Ozaki I, Zhao G, Mizuta T, et al. Hepatocyte growth factor induces collagenase (matrix metalloproteinase-1) via the transcription factor Ets-1 in human hepatic stellate cell line.Journal of Hepatology,2002,36:169-178.

Effects and action mechanism of KLF4 gene silence on collagen metabolism in hepatic stellate cells of rats

LITao*,NIULijuan,LIUWenxuan*,etal.

*DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics,SchoolofPublicHealth,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China

ObjectiveTo investigate the effects of silencing KLF4 expressions on collagen metabolism in hepatic stellate cells-T6 (HSC-T6) of rats.MethodsThe three interference plasmids (pGPU6-1,pGPU6-2,pGPU6-3) targeting at KLF4 gene of rats and negative control plasmid were designed and established.The expression levels of KLF4 mRNA and protein were detected by real time fluorescent quantitation RT- PCR (Real-time RT- PCR) and Western Blot to select out the interference plasmid that had the best silencing effects. Then the interference plasmid (pGPU6-3) was transfected into HSC-T6 cells of rats.On 24h and 48h after transfection, the expression levels of typeⅠcollagen,type Ⅲ collagen,matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) mRNA and protein were detected by Real-time RT- PCR and Western Blot,respectively. Real-time RT-PCR data were analyzed and calculated by 2-ΔΔCtmethod by taking GAPDH as an internal reference,however, Western Blot examination results were analyzed by using β-actin as internal reference protein.ResultsThe examination results by Real-time RT- PCR showed that after HSC-T6 cells of rats were transfected by pGPU6-3, the expression levels of typeⅠcollagen,type Ⅲ collagen and TIMP-1 were decreased by 0.358±0.038,0.298±0.041, 0.478±0.048, respectively, however, the expression levels of MMP-13 mRNA were increased by 1.712±0.034. The Western Blot showed that after HSC-T6 cells of rats were transfected by pGPU6-3, the expression levels of typeⅠcollagen,type Ⅲ collagen and TIMP-1 were decreased by 0.326±0.051,0.283±0.074,0.331±0.039,respectively,however, the expression levels of MMP-13 were increased by 1.273±0.038.ConclusionThe KLF4 gene silencing can significantly decrease the expression levels of typeⅠcollagen and type Ⅲ collagen in HSC-T6 cells of rats,and its action mechanism may be correlated to increasing the expressions of MMP-13 and inhibiting the expressions of TIMP-1.

rat hepatic stellate cells; KLF4;typeⅠcollagen；type Ⅲ collagen；MMP-13

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.009

050017石家庄市，河北医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室(李涛、刘文宣、杨磊、李曼、曹丹丹)；河北省石家庄市第三医院肿瘤科(牛丽娟)；河北省石家庄市第三医院老年病科(彭乱顺)

彭乱顺，050011河北省石家庄市第三医院老年病科；

E-mail：litao771018@163.com

R 575.2

A

1002-7386(2016)20-3080-05

2016-03-29)

项目来源：河北省医学科学研究重点课题计划(编号：20150627)