Tf-USPIO纳米微粒的合成及TfR转基因神经干细胞过表达的研究

杨志军　白妙春　张业森　郭永坤　戴宜武



·论著·

Tf-USPIO纳米微粒的合成及TfR转基因神经干细胞过表达的研究

杨志军白妙春张业森郭永坤戴宜武

目的合成Tf-USPIO纳米微粒以及建立稳定表达TfR的神经干细胞。方法利用慢病毒转染神经干细胞，通过流式细胞仪筛选出稳定表达TfR的神经干细胞，运用WB检测其表达水平。将Tf与USPIO进行偶联，合成Tf-USPIO纳米微粒，通过DLS方法测出USPIO和Tf-USPIO的直径分别为(36±0.7)nm，(43.5±0.08)nm。结果慢病毒成功的转染神经干细胞，通过流式细胞仪器筛选出稳定表达的神经干细胞，并用WB证实了TfR的过表达；通过偶联的方法合成了稳定的Tf-USPIO微粒。结论成功构建了TfR神经干细胞系，合成出稳定的Tf-USPIO纳米微粒。

超小超顺磁性氧化铁；转铁蛋白受体；慢病毒载体；干细胞；磁共振成像

研究证实神经干细胞移植可改善因神经元损伤而出现的临床症状[1]。但到目前为止，未能实现在活体内长期动态观察干细胞的迁移和分化，因此需要一种能够达到长期示踪目的的干细胞。转铁蛋白受体(transferring receptor,TfR)在内皮细胞等大量存在，其主要作用是将细胞外的铁向细胞内转移，是铁代谢的重要过程，其配体转铁蛋白(Tf)可透过血脑屏障(BBB)。同时, 研究发现脑内很多疾病的发生都和铁代谢失调有关。TfR报告基因在磁共振(MR)分子成像中受到高度重视和广泛关注。目前应用较多的 TfR 探针有转铁蛋白-单晶体氧化铁颗粒(Tf-MION)[2]和转铁蛋白-超顺磁性氧化铁纳米粒(Tf-SPION)[3]两种,其在体内外均能MR成像。本文利用慢病毒(pLenti6.3-TfR-IRES-EGFP和pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP)转染神经干细胞(NSCs)，通过流式细胞筛选出稳定表达TfR的神经干细胞系，并通过蛋白印记(Western blotting)证明其过表达；利用USPIO和Tf两者EDC偶联的方法，获得Tf-USPIO螯合物，并通过DLS法测试偶联前后的粒子直径，证明其偶联成功。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞和慢病毒载体系统：小鼠胚胎源性NSCs，本实验室冻存。慢病毒表达载体pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP及pLenti6.3-TfR-IRES-EGFP包装质粒均购自于美国Invitrogen公司。

1.1.2主要试剂：USPIO购自北京万德高科科技公司；Tf、DMEM/F12、bFGF、EGF、Neurobasal培养基、小鼠抗人转铁蛋白受体单克隆抗体、兔抗人转铁蛋白受体单克隆抗体等购自Sigma公司；Sulfo-NHS、EDC购自上海延长科技有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠胚胎源性NSCs的传代培养：①将原代培养细胞悬浮生长至细胞球，体积扩增约4～5倍时，将培养液和悬浮细胞吸入5 ml离心管中，离心机中800 r/min，离心5 min；②弃去培养基后，加入Accuase酶溶液约1 ml，温箱静置10～15 min，加入等体积的培养液终止消化；然后用吸管反复轻柔吹打约20～30次，使细胞球变成单个细胞；③再次将消化的细胞悬液移室温下，转速1 000 r/min，离心5 min，去掉上清，以培养基重悬细胞，轻柔吹打成单细胞悬液，玻片上大概计数后，调整细胞密度至1×106个/ml，接种于25 cm2培养瓶或培养板中；置于37℃，5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2小鼠神经干细胞的冻存及复苏：①冻存细胞时将神经干细胞按上述方法消化为单细胞悬液后，离心后收集神经干细胞，弃去培养液，加入约1 ml神经干细胞(90%培养基+10%DMSO)重悬，计数约1×106个/ml，放入冻存管中，再次加入冻存液，使冻存管中冻存液体积约为1 ml，装入预先解冻(室温下)的冻存盒，放入-80℃冰箱中缓慢降温，24 h后可放入液氮灌中长期保存；②复苏细胞时将冻存管从液氮中取出，快速转入37℃水浴中，一边解冻，一边振荡，待细胞快速解冻；然后将细胞转移到含有2倍体积神经干细胞培养液的离心管中，1 000 r/min，离心4 min，弃上清；离心后用培养液重悬细胞，计数细胞，按1×106cells,5 ml/瓶，接种于25 cm2的培养瓶(一般1个冻存管接种于1个25 cm2的培养瓶)，37℃，5% CO2培养箱中培养。

1.2.3TfR基因转染神经干细胞：①将代数为第6～8代的神经干细胞消化吹打为单个细胞后，计数细胞，以4×105细胞/2 ml接种至12孔培养板中，37℃，5% CO2的培养箱中培养；②培养4 h后，观察细胞状态，取细胞生长状态良好的孔，每孔加入预先解冻含有MOI=10病毒液(TfR组)和MOI=10空载体组(EGFP组)的神经干细胞培养液300 μl，再次放回温箱中继续培养，并设置空白细胞为对照；③12 h后观察细胞状态，半量换液，48 h后再次半量换液。48～72 h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况，并拍照。

1.2.4细胞流式筛选稳定表达TfR的神经干细胞系：①细胞加入感染病毒48～72 h后，收集神经球、消化轻轻吹打成单个细胞。然后用高压灭菌的PBS轻洗1次，1 ml灭菌PBS重悬细胞；②用300目的细胞筛过滤细胞，收集滤过的细胞悬液移入2 ml上样管，送去细胞流式仪分选出含有EGFP的神经干细胞；③筛选后的神经干细胞在离心机上离心，1 000 r/min,离心4 min，去掉上清；加入含有青霉素-链霉素溶液(100×)的神经干细胞培养液重悬，接种于培养瓶中，并在荧光显微镜下拍片。

1.2.5蛋白印记鉴定TfR细胞：①将5×106个筛选后的神经干细胞用1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液煮沸5～10 min直接裂解，提取总蛋白，设置空载体和空白细胞作为对照组，煮好后可用流水降温后放入-80℃保存；②按产品说明书配置10%分离胶，5%浓缩胶，各组取15 μl蛋白上样，初始电压为100 V，大约半小时后当染料边缘进入分离胶后，电压提高到150 V，直至染料迁移至凝胶下端附近；③转膜前将膜置于甲醇中活化20 s，再放入去离子水中洗涤5 min，最后放入转膜中浸泡 20 min，使用半干转移仪在30 V恒压条件下电转40 min，将蛋白转移到PVDF膜上。将转完蛋白的PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的TBST溶液中，摇床上室温下摇晃孵育2 h；④将一抗兔抗人转铁蛋白受体单克隆抗体以1∶1 000稀释于TBST溶液中，密封袋中4℃过夜。第2天TBST液洗膜10 min/次，洗3次；⑤辣根过氧化物酶标记的二抗,1∶5 000稀释于含5%脱脂奶粉/TBST溶液中，室温孵育2 h，TBST液洗膜10 min/次，洗3次；⑥将膜置于平铺好的保鲜膜上,加入预先以1∶1的比例混合A液和B液，并避光反应5 min；⑦将膜取出后封存在透明薄膜中放入暗盒,开始摄像。

1.2.6Tf-USPIO的合成：在中科院化学所合成。① 将含有8 mg Fe/ml的USPIO约11 mg Fe加入1.91 mg EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide conjugation)及5.42 mg sulf-NHS(N-hydroxysulfos uccinimide sodium salt)，室温下反应15 min；②采用PD-10交换柱对活化后的USPIO进行缓冲液交换，洗脱液体采用NaHCO3(0.1 mol/L)，然后取其中9 mg 加入3 mg转铁蛋白(Tf)在室温下进行偶联反应，4 h后采用PBS缓冲液进行透析；③动态光散射(dynamic light scattering，DLS)测定,将0.1 mg/ml的Tf-USPIO和USPIO样品超声分散10 min，在粒度仪上测定水化半径位。

2　结果

2.1光镜下观察刚消化后的细胞，见细胞呈悬浮状态，形态为圆形，大小均一，边缘光滑、完整，折光性强。约12 h后部分细胞开始成球，随时间的增加，细胞球逐渐增大，约3～4 d后细胞球中央成暗黄色，提示细胞需要传代。见图1。

2.2在加入慢病毒感染8 h后可见部分细胞开始有绿色荧光出现，且绿色荧光和转染的效率随时间逐渐增强，36 h可见神经球绿色荧光占据整个球体。见图2。

ABC

图1细胞传代培养(×10);A为细胞刚消化，B为培养12 h，C为培养3 d

AB

图2荧光显微镜下的慢病毒转染神经干细胞×200;A为转染8 h，B为转染36 h

2.3使用细胞流式仪筛选出EGFP阳性细胞传代培养，经5次筛选，最终得到阳性率为98.9%神经干细胞,在荧光显微镜下可发现神经球呈强绿色荧光，明视野下可见神经球生长良好，未转染的神经干细胞都无绿色荧光。见图3、4。

图3　流式细胞分选图

图4转染细胞(上)和未转染细胞(下)荧光显微镜下图片(左侧为荧光光源，右侧为普通光源，标尺为200 μm)

2.4蛋白印记法鉴定后TfR条带出现在相对分子量为90 kDa附近，与TfR的理论值相似，转染TfR细胞组蛋白表达量明显高于空载体EGFP组和未转染组，对照组的表达量很低，实验组细胞TfR的表达水平明显增加，表明成功建立表达TfR的神经干细胞系。见图5。

图5　Western blotting 检测TfR蛋白的表达

2.5DLS是通过测量样本散射光强度起伏的变化计算出样品颗粒大小信息，该技术利用激光照射测量样品颗粒并分析散射光的波动强度(Stokes-Einstein 方程)推导出粒子大小。本实验经统计可得USPIO 的直径为(36±0.7)nm，而 Tf-USPIO 的直径为(43.5±0.08)nm。见图6。

图6　USPIO和Tf-USPIO动态光散射图(DLS)

3　讨论

研究神经干细胞移植效果，需要对移植细胞在动物体内的迁移、分布、存活及增殖和分化进行监测。为了区分供体和自体细胞，需要一种有效的标记方法标记这些细胞。常见的方法包括：免疫组织化学技术、同位素或者荧光标记、MRI成像技术等[4-6]。MRI成像技术因其可以实现无创、动态、长期的示踪，受到越来越多的关注。MRI成像一般先将移植物在体外利用MR增强剂标记后，然后在体外利用磁共振示踪。常见的MR增强剂包括钆类和氧化铁。报告基因技术也可以产生顺磁性物质或吸收顺磁性物质，常见的包括酪氨酸激酶、铁蛋白、转铁蛋白受体等。科学家们已根据肿瘤过表达TfR，设计出了Tf-SPION磁共振探针，并且成功地在磁共振上显像。

本文利用转铁受体蛋白基因慢病毒转染神经干细胞，通过慢病毒感染细胞，其优点是可以转染任何时期的细胞、容纳外源性基因的片段大、长期稳定表达等，其他病毒转染方式包括腺病毒和逆转录病毒。它们与慢病毒相比，腺病毒只能瞬时转染、不能整合到染色体中。逆转录病毒只能感染分裂期细胞、容量有限。本文证实转染后的神经干细胞在荧光显微镜下为绿色，根据其EGFP-TfR基因共表达，证明TfR基因已转入神经干细胞，并根据它们共表达的特性，利用流式筛选的方法筛选出96%以上的稳定表达EGFP的神经干细胞，并将未表达EGFP的细胞弃去，将表达EGFP的细胞裂解，并通过蛋白印记的方法证实了TfR蛋白的过表达，结合先前的实验结果证实了TfR在神经干细胞中的持续表达[7]。

磁共振探针一般都具有顺磁性，理想的磁共振探针应具备以下条件：对靶体具有高度的特异性和亲和力、能够透过生物屏障如细胞膜、血管内皮甚至是血脑屏障、在机体内不会引起排斥反应、与靶体结合后产物不会对机体有不良反应、能与磁共振信号分子偶联。现研究较多的是纳米氧化铁类，因其直径小(纳米级，一般1～100 nm)、且较稳定，特别适合活体磁共振成像。常用的纳米氧化铁颗粒有超顺磁性氧化铁纳米微粒(SPION)、超微顺磁性氧化铁(USPIO)、单晶体氧化铁纳米粒子(MION)等[8-10]，它们各有优缺点。USPIO直径约为4～30 nm，也已经得到商品化，它的体积较小，半衰期长，很少被肝脏代谢，大部分会分布到全身的淋巴结，是MR造影及功能成像的优良新材料，良好的生物相容性，这也是选用USPIO作为转基因神经干细胞探针的重要原因[11]。

DLS是动态光散射的意思，它是利用激光照射运动颗粒，其散射光强度也产生随机的波动，并且它的波动频率与颗粒的大小有关，正是利用这种变化来测量和分析颗粒的大小。它是测量纳米颗粒的有效方法，具有以下优点：测量速度快、范围大、样品量小、不影响原有状态，EDC是一种活化COOH的，然后可以和蛋白或者氨基酸反应，但是EDC反应的中间产物往往不稳定，最好用sulfo-NHS活化，本部分通过EDC偶联的方法将Tf和USPIO联合在一起，预先应用PEG包被的USPIO表面含有大量羧基，并且其在血液内较稳定，使其极易和Tf发生反应而形成复合物。DLS实验显示USPIO 的直径为(36±0.7)nm，而 Tf-USPIO 的直径为(43.5±0.08)nm，显示偶联后的直径变大，说明一种可能即Tf和USPIO成功偶联，从以下几方面考虑：(1)他们有没有发生静电吸附的条件，即转铁蛋白和uspio的表面电荷是否相反；(2)从极性方面考虑，他们之间的亲和力也并不强；(3)化学耦联效率高，结构稳定，在耦联反应试剂过量时，几乎都耦联上了。然后，如果是非特异性吸附上的，他们的结合力是很弱的，在细胞实验过程中很可能就脱离了，不会对特异性摄取有什么贡献。而在摄取实验中，特异性摄取那么多，从侧面也证明了耦联是有效的。

我们成功地利用慢病毒转染的方法转染神经干细胞，并使细胞过表达TfR，且能传代下去。利用流式细胞仪筛选了稳定表达TfR的神经干细胞系，成功的利用EDC藕联的方法合成了Tf-USPIO，并证实其在体外具有良好水溶性和稳定性，为下一步转基因干细胞的体外探针成像提供了实验基础。

1Takagi Y.History of Neural Stem Cell Research and Its Clinical Application.Neurol Med Chir (Tokyo),2016,56:110-124.

2Moore A,Josephson L,Bhorade B,et al.Human transferrin receptor gene as a marker gene for MR imaging.Radiology,2001,221:244-250.

3Jiang W, Xie H,Ghoorah D,et al.Conjugation of functionalized SPIONs with transferrin for targeting and imaging brain glial tumors in rat model.Plo S one,2012,7:e37376.

4Bhattacharya S,Jackson JD,Das AV,et al.Direct identification and enrichment of retinal stem cells/progenitors by Hoechst dye efflux assay.Invest Ophthalmol Vis Sci,2003,44:2764-2773.

5Ntziachristos V,Ripoll J,Wang LV,et al．Looking and listening to light：the evolution of whole-body photonic imaging．Nat Biotech，2005，23：313-320．

6文明，李少林.磁共振成像用于分子影像学研究.中国医学影像技术，2007,23:147-150.

7郭永坤,张业森,杨志军,等.hTfR报告基因慢病毒载体的构建及其在神经干细胞的表达研究.中华神经医学杂志,2013,12:433-437.

8Harisinghani MG,Barentsz J,Hahn PF,et al.Noninvasive detection of clinically occult lymph-node metastases in prostate cancer.N Engl J Med,2003,348:2491-2495.

9Yang J,Wadghiri YZ,Hoang DM,et al.Detection of amyloid plaques targeted by USPIO-Aβ1-42 in Alzheimer’s disease transgenic mice using magnetic resonance microimaging.Neuroimage,2011,55:1600-1609.

10Smolensky ED,Park HY,Berquó TS,et al.Surface functionalization of magnetic iron oxide nanoparticles for MRI applications-effect of anchoring group and ligand exchange protocol.Contrast Media Mol Imaging,2011,6:189-199.

11Parsa H,Shamsasenjan K,Movassaghpour A,et al.Effect of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles-Labeling on Mouse Embryonic Stem Cells.Cell J,2015,17:221-230.

Study on the synthesis of Tf-USPIO nanometer particle and overexpression of TfR transgenic neural stem cells

YANGZhijun,BAIMiaochun,ZHANGYesen,etal.Bayi

HospitalforEncephalopathyAffiliatedtoPLAArmyGeneralHospital,Beijing100700,China

ObjectiveTo synthesize Tf-USPIO nanometer particle and establish the neural stem cells system that can express transferrin receptors (TfR) stably. MethodsThe neural stem cells were transfected by lentivirus,then the neural stem cells that could express TfR stably were selected out by flow cytometry.The expression levels of TfR were detected by Western Blotting.The TF was coupled with USPIO to synthesize Tf-USPIO nanometer particle,which were measured by DLS method,with the diameters of USPIO and Tf-USPIO being (36±0.7)nm,(43.5±0.08)nm, respectively.ResultsThe neural stem cells were transfected by lentivirus successfully,and the neural stem cells that could express TfR stably were selected out by flow cytometry successfully,moreover, the overexpression of TfR was identified by Western Blotting. The stable Tf-USPIO nanometer particles were synthesized by link-coupled method.ConclusionThe TfR neural stem cells line is successfully established,which can synthesize stable Tf-USPIO nanometer particles.

ultra-small superparamagnetic iron oxide; transferrin receptors; lentivirus vector; stem cell; magnetic resonance imaging

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.001

100700北京市，中国人民解放军陆军总医院附属八一脑科医院

R 622.3

A

1002-7386(2016)20-3045-04

2016-04-25)

项目来源：国家自然科学基金项目(编号：81271316)