黄芩苷对大鼠牙周炎牙龈组织中TNF-αmRNA和IL-6mRNA表达的影响

李会英　李国兴　崔佳　刘哲敏　杜宁　刘学聪　乔玉巧



·论著·

黄芩苷对大鼠牙周炎牙龈组织中TNF-αmRNA和IL-6mRNA表达的影响

李会英李国兴崔佳刘哲敏杜宁刘学聪乔玉巧

目的观察黄芩苷对牙周炎大鼠牙龈组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA、白细胞介素-6(IL-6)mRNA表达的影响，探讨黄芩苷治疗牙周炎的治疗机制。方法选用50只8周龄SD大鼠，随机分成5组,每组10只，A组为正常对照组， B组为牙周炎组，C1、C2、C3组为黄芩苷治疗组，B，C1，C2，C3组建立牙周炎模型，治疗1周后处死，采用RT-PCR方法检测TNF-αmRNA、IL-6mRNA在5组大鼠牙龈组织中的表达水平。结果牙周炎组大鼠牙龈组织中TNF-αmRNA、IL-6mRNA表达强度显著高于正常对照组(P<0.05)，黄芩苷各治疗组大鼠牙龈组织中TNF-αmRNA、IL-6mRNA表达强度均明显低于牙周炎组(P<0.05)。结论黄芩苷可以降低牙周炎大鼠牙龈组织中TNF-αmRNA、IL-6mRNA的表达含量，并能改善大鼠牙周组织状况。

黄芩苷；牙周炎；细胞因子；RT-PCR

牙周炎是累及牙周支持组织的炎症性疾病，主要表现为牙龈慢性炎症、牙槽骨吸收和牙周袋形成。研究发现牙周炎患者炎症牙龈和龈沟液中TNF-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-6(interleukin-6，IL-6)等炎症细胞因子水平升高[1]，炎性细胞因子TNF-α和IL-6的主要功能是致炎作用,并能直接或间接地介导骨组织吸收。研究发现黄芩苷对牙周炎具有一定的治疗效果[2],但其相关治疗机制尚不清楚。本研究采用大肠杆菌脂多糖诱导建立大鼠牙周炎模型，通过局部牙龈注射黄芩苷对牙周炎大鼠进行治疗，利用RT-PCR技术，从mRNA水平检测大鼠牙龈组织中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表达水平,观察大鼠牙周组织变化情况，探讨黄芩苷局部治疗牙周炎的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物：SD大鼠50只，清洁级，8周龄，雄性，体重(220±20)g，由河北医科大学实验动物中心提供(动物合格证号：1410084)。大鼠适应环境1周后进行实验。喂饲实验动物中心的标准动物饲料，自由摄取水和食物。

1.1.2主要药品与仪器：大肠杆菌ATCC O55:B5的脂多糖 (美国，sigma公司)，黄芩苷(中国药物生物制品检定所)；总RNA提取试剂TRIzol Reagent(GIBCOBRL公司,美国)；逆转录试剂与PCR试剂SYBR®PrimeScript®RT-PCR Kit (TaKaRa公司，日本)；TNF-αand IL-6及GADPH引物(上海生工生物工程有限公司)；Kodak_1DDC_120电泳凝胶成像自动分析系统(Kodak公司,美国)；7500荧光定量PCR仪(AB公司；美国)。

1.2实验方法

1.2.1溶液的配制：取2 mg黄芩苷溶于2 ml 0.9%氯化钠溶液中，碳酸氢钠调pH值至7.4，至黄芩苷完全溶解，成为1 mg/ml的储存液，4℃保存备用，试验时用0.9%氯化钠溶液稀释至所需浓度；取10 mg脂多糖(LPS)，用0.9%氯化钠溶液稀释至1 mg/ml的溶液。LPS的终末浓度为1 mg/ml，黄芩苷终末浓度为0.01、0.1、1.0 μg/ml。

1.2.2动物分组及牙周炎模型的建立：取SD大鼠50只,随机分5组：对照组(A组)、牙周炎组 (B组)、黄芩苷治疗组(C1、C2、C3组)，每组10只。除A组外,其余4组大鼠用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉成功后，选大鼠右上颌第1、2磨牙之间颊腭侧龈沟底注射LPS(1 mg/ml)各0.2 ml，每天在同一部位重复1次，连续3天，1周后大鼠牙周炎模型建立。

1.2.3黄芩苷的局部治疗：大鼠牙周炎模型建立后第2天开始用药，A组不用药，黄芩苷治疗组(C1、C2、C3组)每天在大鼠右上颌第1、2磨牙之间颊腭侧龈沟底分别注射0.01、0.1、1.0 μg/ml黄芩苷溶液各0.2 ml，B组注射等量0.9%氯化钠溶液，均连续3 d，分笼饲养。用药前、后分别观察各组大鼠牙周组织、全身状况、毛发、食欲及粪便情况。

1.2.4动物处死及标本采集：用药后第7天，采取颈椎脱臼法处死各组大鼠，5 min内剪取大鼠右上颌第1、2磨牙、牙槽骨及牙周组织，0.9%氯化钠溶液冲洗后置于10%甲醛固定、10%EDTA脱钙、包埋，制作右上颌磨牙颊腭向石蜡切片，片厚5 μm，苏木精-伊红染色，于光学显微镜下观察牙槽骨吸收及牙周袋形成情况；另取右上颌第1、2磨牙颊腭侧实验处新鲜牙龈组织放置于eppendorf管中，液氮骤冷后，-70℃冰箱保存，用于TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的检测。

1.2.5RT-PCR检测大鼠牙龈组织中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的表达水平：①提取RNA 将牙龈标本复融，取0.1 g，粉碎至匀浆状，加入1 ml RNA裂解液吹打均匀，加入200 μl氯仿混匀，13 000 r/min 4℃离心15 min。取上清液加入500 μl异戊醇-30℃放置12 h，离心同上。弃上清液，加75%乙醇200 μl洗涤，再次离心同上，弃上清液得白色沉淀，加入50 μl聚碳酸二乙酯(diethlpyrocarbonate，DEPC)，置-20℃冰箱备用。采用紫外分光光度计测定RNA纯度。②逆转录合成cDNA 分别取1 μl TNF-α mRNA、 IL-6 mRNA，2×缓冲液(buffer)5 μl，2 mmol/L MgSO42 μl，10 mmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTPs )0.5 μl，40 U/μl RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)0.25 μl，逆转录酶(Bca Best polymerase)0.5 μl，寡脱氧胸苷酸(OligodT)0.5 μl，以双蒸水补足反应体积至10 μl，操作严格按试剂盒说明书进行。③PCR扩增 PCR反应体系为20 μl，其中包括SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，Rox Reference DyeⅡ(50×) 0.4 μl，上下游引物(10 μM)各0.4 μl，cDNA模板2 μl及d H2O 6.8 μl。置于7500 real-time PCR仪上，两步法PCR扩增，扩增程序为：第一步 预变性：95℃ 30 s；第二步 PCR反应：95℃ 5 s，60℃ 1 min，40个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证。以 GAPDH 作为内参照，所用引物序列如下。见表1。

表1　基因引物的碱基序列

2　结果

2.1实验动物的一般情况A组大鼠牙龈组织无红肿充血及牙周袋形成，体重逐渐增加，毛泽光亮，神态、活动、进食水、大便均正常。B、C1、C2、C3组大鼠于注射LPS后第2天出现牙龈组织红肿，神态倦怠、活动笨拙、皮毛疏松无光泽、进食水减少、大便干燥等症状，随着注射LPS次数的增加，上述症状逐渐加重；B组注射0.9%氯化钠溶液后牙龈组织仍然红肿，牙周袋形成，探诊深度4～5 mm，神态倦怠、活动笨拙、皮毛无光泽、进食水下降、大便干燥等症状无明显改善，而C1、C2、C3组随着注射黄芩苷治疗时间的增加，上述症状逐渐改善，用药3天后，牙龈组织红肿充血减轻，牙周袋探诊深度3～4 mm，神态趋于正常，皮毛光泽改善，进食及活动增多，大便偶有干燥，并且C3组效果最明显。

2.2牙周组织病理变化光镜下可见，B组大鼠的牙龈上皮和皮下结缔组织局部溃疡、坏死，牙周膜纤维排列紊乱，牙周袋形成，牙槽嵴吸收明显，表面呈蚕食状，牙槽骨可见明显的破骨细胞和骨吸收陷窝；C1、C2、C3组与B组比较，牙周组织表现为牙龈上皮和上皮下结缔组织较完整，牙周膜主纤维束排列较整齐，牙周袋形成与牙槽嵴吸收较轻，炎性细胞逐渐减少，成纤维细胞增多，牙周间隙较正常，牙周膜及牙槽骨结构趋于正常，牙周组织处于炎症修复期；A组牙龈上皮和上皮下结缔组织光滑完整，牙周膜纤维排列整齐，牙槽骨表面光滑，无明显骨吸收、破骨细胞及骨吸收陷窝形成。见图1。

A组 正常对照组　　　B组 牙周炎组　　　　　C1、C2、C3组 黄芩苷治疗组

图15组牙周组织形态(HE×10)

2.3黄芩苷对大鼠牙龈组织中TNF-αmRNA 、IL-6 mRNA表达水平的影响B组大鼠牙龈组织中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表达水平明显高于A组(P<0.05)；与B组比较,C1、C2、C3组大鼠牙龈组织中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表达水平均明显降低(P<0.05)，且C1、C2、C3组TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA表达水平依次逐渐下降(P<0.05)。B组大鼠牙龈组织中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA表达强度明显高于A组大鼠；局部应用黄芩苷治疗后1周后,C1、C2、C3组较牙周炎组大鼠牙龈组织中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表达强度随黄芩苷浓度增加依次明显下降。见表2,图2。

组别TNF-α(fold)IL-6(fold)A组32.34±4.6325.40±2.93B组87.33±5.38*68.27±0.33*C1组63.67±3.67*#55.39±4.41*#C2组51.75±6.00*#45.44±3.78*#C3组41.45±3.79*#36.33±4.04*# F值60.0670.27 P值5.91×10-72.79×10-7

注：与A组比较，*P<0.05;与B组比较，#P<0.05

3　讨论

牙周炎是一种以骨破坏为主要特征的慢性细菌感染性疾病，发生在牙齿的支持组织，是由革兰氏阴性(G-)厌氧菌、鞭毛菌、螺旋体等微生物引起的炎症性疾病，其中G-厌氧菌及其内毒素刺激可引起宿主局部免疫细胞反应,从而激活宿主防御细胞释放TNF-α和 IL-6等多种炎症细胞因子，这些炎症细胞因子继发引起牙龈组织炎症、牙槽骨破坏和吸收等牙周组织损伤[2，3]。内毒素是G-细菌细胞壁外膜中的脂多糖(LPS),是G-细菌细胞壁外膜所独有的一种致病物质,对牙周组织具有很高的毒性。在不同微生物之间，LPS的化学组成有所不同，但其基本结构相似。LPS的生物活性中心是类脂A，几乎可介导所有LPS的生物学反应,并且类脂A在各种G-菌中的结构和化学成分相似,无种属特异性,因此不同种属G-细菌的LPS引起的毒性作用基本相似[4]。根据amamurthy的参考文献，采用大肠杆菌LPS诱导大鼠实验牙周炎模型, 已由SUNY Stony Brook动物用户委员会认可[3]。 LPS诱导的大鼠牙周炎模型,简便、可比性强,具有可重复性。本实验采用大肠杆菌LPS进行实验，连续 3 d 在大鼠右上颌磨牙同一部位的牙龈组织中注射LPS,1周后牙周袋形成,牙龈红肿,探诊出血。光镜下,炎症细胞聚集,破骨细胞浸润,牙槽骨吸收。

在牙周炎发生发展过程中，牙周组织中单核细胞、巨噬细胞、多形核白细胞、牙龈及牙周膜成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和成骨细胞等均可分泌TNF-α、IL-1、IL-6等炎症细胞因子，这些细胞因子可以诱导白细胞和内皮细胞粘附分子的上调，刺激趋化因子的产生和聚集；诱导其他可放大或维持炎症反应的介质表达，例如前列腺素；刺激组织溶解酶产生，例如基质金属蛋白酶；提高细菌杀伤力和噬菌活性[5]。研究发现，TNF-α诱导骨吸收的活性较强，通过刺激胶原酶介导组织破坏，诱导破骨细胞的前体细胞增生、分化，并间接作用于成熟的破骨细胞，造成牙槽骨的破坏和吸收，也是刺激前列腺素和蛋白酶产生的主要因子，在牙周组织破坏中起重要作用；IL-6是一种多效应炎性细胞因子,细菌﹑病毒﹑寄生虫﹑脂多糖等均可提高其基因表达，IL-6的生物功能较多，可诱导B淋巴细胞分化并分泌免疫球蛋白，促进多种细胞如T淋巴细胞、造血干细胞等的增殖，抑制成纤维细胞的生长，参与骨吸收，有效地抑制IL-6的分泌和合成,对牙周炎的治疗有重要意义[3,6]。有研究显示在牙周炎患者的龈沟液和牙龈组织中可检测到高水平的TNF-α、IL-6，其表达水平和牙周炎症的严重程度明显相关[7，8]。因此通过药物抑制这些炎症细胞因子的表达水平对于抑制牙周炎症反应具有重要意义[9，10]。

研究表明，黄芩苷是中药黄芩的主要有效成分，具有抑菌、清热、抗变态反应等多种作用，黄芩苷可通过清除LPS诱生的自由基,阻断LPS破坏细胞生物膜系统, 稳定细胞膜,从而保护细胞表面,抑制牙周细胞分泌炎性细胞因子，并可抑制其发挥作用[11]。陈悦等[12]研究认为黄芩苷抑制牙周炎和牙槽骨吸收的机理可能是通过巨噬细胞分泌 TGF-β，从而抑制T细胞的活性、增殖和数量，导致 T细胞产生的TNF-α等炎性因子减少，引起破骨细胞减少，从而抑制牙槽骨破骨细胞的生成，牙周炎症状减轻。罗志晓等[13]研究发现黄芩苷可阻止成纤维细胞和炎性细胞的相互作用，抑制炎性细胞因子以及金属基质蛋白酶等的合成和分泌，减少炎性细胞的聚集、滞留及牙槽骨的破坏，阻止牙周炎病程进展。王国芳等[14]研究发现淫羊藿苷、黄芩苷和大黄素联合应用对脂多糖诱导的实验性牙周炎牙槽骨吸收具有一定的抑制作用。有研究还发现黄芩苷在体外能显著降解内毒素[15],对LPS致鼠巨噬细胞过度释放TNF-α有抑制作用[16]。

本实验通过牙龈局部注射LPS成功建立大鼠实验性牙周炎模型后，使用不同浓度黄芩苷牙龈局部注射治疗大鼠牙周炎，观察大鼠牙周组织变化状况，采用RT-PCR法检测大鼠牙龈组织中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA表达水平的变化，从而探讨黄芩苷治疗牙周炎的疗效与机制。结果显示，与牙周炎组相比，局部注射黄芩苷后，各治疗组大鼠牙龈组织充血肿胀减轻，牙周袋变浅，神态趋于正常，皮毛光泽改善，进食及活动增多，体重逐渐增加，浓度为0.01 ～1.0 μg/ml黄芩苷均能抑制大鼠牙龈组织中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的表达，随着黄芩苷浓度升高，TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA表达水平逐渐降低，不同浓度组间比较，抑制作用有显著性差异(P<0.05)。因此本研究表明，黄芩苷可降低实验性牙周炎大鼠牙龈组织中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的表达水平，减轻机体炎性反应，抑制牙槽骨吸收，提示临床上局部应用黄芩苷治疗牙周炎，可能会减轻牙周炎的炎性反应，抑制破骨细胞形成，促进牙周病患者的康复，但是黄芩苷的确切作用机制还有待于进一步研究。

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Effects of baicalin on the expressions of TNF-αmRNA and IL-6mRNA in gingiva tissues of rat with periodontitis

LIHuiying,LIGuoxing,CUIJia,etal.

DepartmentofStomatology,HebeiProvincialChildren’sHospital,Shijiazhuang050031,China

ObjectiveTo observe the effects of baicalin on the expressions of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) mRNA and interleukin-6 (IL-6) mRNA in gingiva tissues of rat with periodontitis in order to explore the action mechanism of baicalin in treatment of periodontitis.MethodsFifty SD rats (8-week age) were randomly divided into 5 groups:blank control group (group A), periodontitis group (group B), baicalin treatment groups including group C1,group C2,group C3,with 10 rats in each group.The animal models with periodontitis were established in group B,group C1,group C2 and group C3.All the rats were sacrificed after 7-day treatment,and the expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique.ResultsThe expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in gingiva tissues of rats in group B were significantly higher than those in group A (P<0.05),moreover, the expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in group C1,group C2 and group C3 were significantly lower than those in group B (P<0.05).ConclusionThe baicalin can decrease the expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in gingiva tissues of rat with periodontitis, and can also improve the status of periodontal tissues.

baicalin；periodontitis；cytokines；reverse transcription polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.006

050031石家庄市,河北省儿童医院口腔科

刘学聪，050031石家庄市，河北省儿童医院口腔科；

E-mail: lgxlhy@163.com

R 781.42

A

1002-7386(2016)20-3068-04

2016-04-17)

项目来源：河北省中医药管理局中医药类科研计划课题(编号:2013181)