采用响应面法优化高浓度发酵探究

王秋峰，杜风光，刘　钺，乔建援，李　勇，王方方，刘　燕

（河南天冠企业集团有限公司，车用生物燃料技术国家重点实验室，河南南阳473000）

采用响应面法优化高浓度发酵探究

王秋峰，杜风光，刘钺，乔建援，李勇，王方方，刘燕

（河南天冠企业集团有限公司，车用生物燃料技术国家重点实验室，河南南阳473000）

高浓度发酵在当下酒精发酵行业是势在必行。实现高浓度发酵，在采用高效酵母的同时，控制主发酵期的温度是很必要的。发酵温度由34℃降低为32.5℃，酒精度将达到16%vol以上，总糖维持在生产要求的2.5%左右，通过响应面法对高浓度发酵的条件进行优化，为生产提供参考和依据。

高浓度发酵； 响应面法； 发酵温控； 酒精

随着国家减少碳排量目标的制定，而汽车保有量的不断增加，燃料乙醇工业缓解了石油资源短缺的问题，减轻了对进口石油的依赖程度［1］。燃料乙醇是大势所趋，但是我国的酒精发酵行业却面临如下问题：如原料供应问题，按照规划，到2020年我国的燃料乙醇目标为1500 万t，而对应的粮食消耗为4200万t，需要采用非粮作物如木薯、糖类和纤维质等［2-3］生产酒精。经过几十年的发展，我国酒精厂的发酵醪酒精含量与国外还是有一定的差距，提高酒精发酵罐的发酵能力，降低能耗、水耗，降低成本，最有效的途径就是采用提高酒精浓度即浓醪发酵［5］。虽然浓醪发酵技术有许多好处，但是应用过程还有许多问题需要解决，首先高浓度发酵需要耐高浓度、耐高温以及耐高酒度的优良菌株，其次要提高生产管控水平，对发酵过程温度过高能够及时有效地调节和管控。否则盲目提高浓度可能酿成生产事故。

本实验以天冠集团与浙江大学合作选育的耐高酒精度、耐高温与耐高浓度菌株作为菌种，结合生产车间原料为发酵醪，应用降低开发成本、优化实验条件、提高生产效率、有效的响应面优化法［6-9］对工艺进行优化，为生产提供参考和依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

菌种：天冠集团实验中心高转项目组实验室保藏。实验原料：木薯粉、玉米粉、A/B淀粉浆，燃料乙醇生产车间。

实验试剂：神舟糖化酶，酶活力100000 U/mL；诺维信液化酶，酶活力70000 U/mL；隆大酸性蛋白酶，酶活力50000 U/mL；尿素。

仪器设备：电热恒温水浴锅，DK-S28，上海精宏实验设备有限公司；电热恒温培养箱，DHP-2010，华利达实验仪器公司；恒温培养振荡器，ZHWY-211C，上海智城分析仪器制造有限公司；万用电炉，DL-1北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2实验方法

工艺流程：混合原料分组液化后再混合→稀释一定量液化醪接菌种制作酒母→向成熟酵母中添加液化醪并且同步糖化发酵→蒸馏。

实验过程尽量模拟生产过程进行。采用混合原料发酵（玉米、小麦、木薯），分组液化可以提高物料的利用率以及降低能耗，即将玉米与水按比例混合后，添加高温液化酶以95～100℃液化2～3 h，木薯粉与小麦淀粉浆（小麦通过洗滤后制成的淀粉浆）混合后，添加高温液化酶以90～95℃液化，冷却后按一定比例混合。在实验室三角瓶摇床发酵，采用三角瓶中直接培养酒母，待培养成熟后（细胞数1亿/mL，出芽率20%以上）向三角瓶中添加液化醪糖化酶进行同步糖化发酵。

1.3分析方法

酒精度的测定、总酸的分析、外观糖的测定、残还原糖的测定、残总糖的测定按文献［10］方法进行。

1.4高浓度发酵的单因素实验

1.4.1发酵浓度对酒精发酵的影响

将液化醪稀释至物料浓度为25%，装入1000 mL三角瓶中接种发酵菌落培养，培养成熟后，分别添加不同浓度的液化醪，使总发酵浓度分别为270 g/L、290 g/L、310 g/L，在32℃培养箱中摇动发酵，转速为100 r/min，直至发酵结束（失重小于0.2 g/h），检测其酒精度。重复3次，取其平均值。

1.4.2发酵温度对酒精发酵的影响

将液化醪稀释至物料浓度为25%，装入1000 mL三角瓶中接种发酵菌落培养，培养成熟后，分别添加不同浓度的液化醪使总发酵浓度为290 g/L，分别在30℃、32℃、34℃温度下发酵，培养箱中摇动发酵，转速为100 r/min，直至发酵结束（失重小于0.2 g/h），检测其酒精度。重复3次，取其平均值。

1.4.3发酵时间对酒精发酵的影响

将液化醪稀释至物料浓度为25%，装入1000 mL三角瓶中接种发酵菌落培养，培养成熟后，分别添加不同浓度的液化醪使总发酵浓度为290 g/L，发酵温度为32℃，培养箱中摇动发酵，转速为100 r/min，分别在60 h、66 h 和72 h检测其酒精度。重复3次，取其平均值。

1.5高浓度酒精发酵的响应面设计

在单因素实验基础上，采用Box-Behnken模型选取发酵浓度、发酵温度以及发酵时间作为响应面法的考察因素。以酒精度作为响应值，用统计学软件Design-Expert 8.0设计3因素3水平响应面分析实验，各因素的编码与取值见表1。

表1　响应面编码与取值情况

2　结果与分析

2.1单因素实验结果

2.1.1发酵浓度对酒精发酵的影响（图1）

由图1可知，32℃时随着浓度的升高，酒精产量不断增加，当浓度达到290 g/L后，酒精含量升高不显著，而且随着浓度升高，酒精产率反而降低，原因是酵母受到过高的糖浓度胁迫使发酵无法进行。

2.1.2发酵温度对浓醪酒精发酵的影响（图2）

图1　不同浓度原料发酵结果的影响

图2　不同温度对浓醪酒精发酵的影响

由图2可知，发酵浓度为290 g/L，在28℃下发酵很缓慢，在64 h后发酵酒精度不高，随着温度升高，发酵速率加快，在一定时间内物料得到更充分利用，但是随着发酵温度的升高，产酒精率不断下降，是由于浓醪发酵势必产生高浓度的酒精，高温造成酒精对酵母的损害作用，而温度的升高加剧了该损害作用使酵母大量死亡，发酵无法进行。

2.1.3发酵时间对浓醪发酵的影响（图3）

图3　不同发酵时间对浓醪发酵的影响

由图3可知，在发酵浓度为290 g/L、发酵温度为32℃，发酵到72 h时，随着发酵时间进行而酒精度不断上升，72 h后，随着时间延长，生酸污染的风险增大而且延长时间不利于提高设备利用率。

2.2响应面实验结果（表2）

2.3回归模型的建立（表3）

通过统计软件Design-Expert 8.0以酒精度为响应值，对表2进行多元回归拟合，得出参数的初步回归模型：

表2　响应面设计与结果

剔除不显著项，经过优化后回归模型为：

表3　酒精度回归模型方差分析

由表3可知，模型P值为0.0015表明回归模型方程极显著：失拟项0.4579＞0.05，表明不显著，模型的校正决定系数为RADJ=0.9330，表明回归模型与实测数值可以较好的拟合。变异系数（CV）表示实验的精确度，值越大，实验结果的可靠度越低，实验CV为1.67%在可接受范围，表明此模型可以对酒精度结果进行分析和预测。

回归方程各变量系数显著性检验可知，模型（1）的一次项中A-温度、B-浓度影响极为显著，C-时间影响不显著，交互项都不显著，二次项A2影响显著。

2.4酒精发酵工艺优化以及验证

通过Design-Expert软件设计对高浓度发酵的温度控制进行优化，设计的最适浓度为310 g/L，发酵温度为30.70℃，发酵时间为68.3 h，预测酒度为16.44%vol，考虑到实际的生产控制情况，以及设备利用率，在进行3组平行验证实验时将温度调高到32.5℃，发酵浓度290 g/L，发酵时间64 h，发酵结果为酒度15.8%vol，比软件预测的15.55%vol提高了1.6%vol，在国内属于先进水平，可以将此发酵工艺设为最佳生产参数。

3　结论

高浓度发酵的前提条件是选育耐高酒、耐高温与耐高浓度菌株作为菌种，天冠企业集团通过与浙江大学合作选育优良菌株［11］并且与生产紧密结合，使该企业的发酵酒度与原料利用率得到比较大的提高。

由于发酵温度对微生物生命活动影响很大，发酵结果的好坏与温控有密切关系，所以在进行高浓度发酵时一定要做好温控工作，可以选择温度较低的季节或者加大板冷以及打循环的强度。

通过Design-Expert软件设计对高浓度发酵的温度控制进行优化，设计的最适浓度为310 g/L，发酵温度为30.70℃，发酵时间为68.3 h，预测酒度为16.44%vol，在考虑到实际的生产控制情况，将温度调高到32.5℃，发酵浓度为290 g/L，发酵时间为64 h，发酵结果为酒度15.8%vol，比软件预测的15.55%vol还提高了1.6%vol，结合实际的生产工艺管控以及管理水平，可以适当降低发酵温度同时调高发酵浓度，充分利用资源做到提高生产率、提高原料利用率、节能增效才是企业发展之道。

［1］王成军.燃料乙醇在美国和巴西的发展［J］.国际石油经济，2005，13（5）：51.

［2］陶荣，白晓峰，蒋磊.未来可持续发展的新动力——秸秆发酵制酒精［J］.酿酒，2006，33（3）：45-49.

［3］马晓健，赵银峰，祝春进，等.以纤维素类物质为原料发酵生产燃料乙醇的研究进展［J］.食品与发酵工业，2004（11）：77-81.

［4］方亚叶.酒精废糟液的综合处理［J］.酿酒，2003，30（1）：74-79.

［5］黄宇彤.酒精浓醪发酵菌种选育及发酵条件的优化［D］.天津：天津科技大学，2002.

［6］陆燕，梅乐和，陆悦飞，等.响应面法优化工程菌产细胞色素P450 BM-3的发酵条件［J］.化工学报，2006（5）：1187-1192.

［7］ 蒋丹丹，张彬，梁志宏，等.响应面法优化降胆固醇马红球菌F21-1的发酵培养基［J］.中国农业大学学报，2008（2）：20-24.

［8］郝学财，余晓斌，刘志钰，等.响应面方法在优化微生物培养基中的应用［J］.食品研究与开发，2006（1）：38-41.

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［10］王福荣.酿酒分析与检测［M］.北京：化学工业出版社，2005：230-270.

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Optimization of High-Concentration Fermentation by Response Surface Method

WANG Qiufeng，DU Fengguang，LIU Yue，QIAO Jianyuan，LI Yong，WANG Fangfang and LIU Yan
（State Key Lab of Motor Vehicle Biofuel Technology，He'nan Tianguan Enterprise Group Co.Ltd.，Nanyang，He'nan 473000，China）

High-concentration fermentation is imperative in alcohol fermentation industry at present.Except for the use of high-efficiency yeast，it is necessary to control the temperature during chief fermentation period.In the experiment，as fermentation temperature dropped from 34℃to 32.5℃，alcohol content would reach above 16%vol with total sugar content at around 2.5%，which met the requirements of the production.The optimization of high-concentration fermentation by response surface method provided reference for practical production.

high-concentration fermentation；response surface method；temperature control；alcohol

TS262.2；TS261.4

A

1001-9286（2016）09-0086-03

10.13746/j.njkj.2016170

2016-05-19

王秋峰（1983-），硕士研究生，工程师，研究方向：生物能源研究。