东北高寒地区果树腐烂病病原菌分离、检测与抑制探究

王 雪，于菁妮，马现成，兰 莹，张跃华*



东北高寒地区果树腐烂病病原菌分离、检测与抑制探究

王 雪1，于菁妮2，马现成2，兰 莹1，张跃华2*

（1. 佳木斯大学理学院，黑龙江佳木斯 154007；2. 佳木斯大学农业与环境生物技术研究所，黑龙江佳木斯 154007）

为明确东北高寒地区苹果树腐烂病病原菌的致病力及酚类物质对其抑制效果。以黑龙江省红兴隆管局五九七农场林果业基地为实验样地，从患病果树腐烂病病斑处分离菌株，进行病原菌致病力检测，并以丁香酚及愈创木酚为抑制剂，探究其对病原菌的抑制作用。共分离出苹果树腐烂病致病菌4种，分别记为FA、FB、FC、FD，对4种病原菌进行致病力检测实验，结果显示：FC病斑直径最大可达2.56 cm，致病率为76.67%；FA病斑直径最小为1.27 cm，致病力仅为43.33%；由此可知，FC的致病力最高，FA的致病力最低。抑制试验结果表明，当抑制剂愈创木酚的浓度达到5.5%时，可对4种病原菌进行全面抑制，而丁香酚浓度达到2.0%时就可达到同样效果，因此，丁香酚、愈创木酚作为抑制剂对苹果树腐烂病病原菌均有抑制效果，其中丁香酚的抑制效果优于愈创木酚。

高寒地区；果树腐烂病；病原菌；致病力；抑制试验

苹果树腐烂病()是我国苹果树常见的一种病害，会造成树势衰弱、枝干枯死、死树，甚至毁园，严重制约我国苹果行业的发展[1]。该病于1903年在日本首次被发现，1909年宫部、山田研究证明该病属于真菌性病害，并将该病的病原菌命名为[2]。我国最早于辽宁省南部发现[3]，并于1949年和1960年发生两次大范围暴发[2]。果树腐烂病会造成果树大面积减产、降低果农收入，使我国果农遭受严重经济损失[4]。黑龙江五九七农场果园有着“中国绿色寒疆果都”之称，果园面积有1.2万亩，主要种植苹果，其品种有金红苹果、K9、123、农冠等。2015年林茹等人调查得到五九七农场果园苹果树(K9、123、农冠)腐烂病平均发病率在30.99%~33.44%[5]。

生产上对于苹果树腐烂病的防控主要依靠化学农药，然而长期大量使用化学杀菌剂不仅使果园生态环境恶化、给食品安全带来极大隐患，而且容易导致抗药性菌株的出现，因此，寻求对环境友好且高效的防治方法已成为亟待解决的问题[6]。针对五九七农场果园苹果树的腐烂病现状，本课题组对苹果树腐烂病病疤样品进行采集，选用丁香酚及愈创木酚作为病原菌抑制剂，进行了初步的致病菌分离、致病力检测及抑制探究，以期得到无残留高效控制腐烂病病原菌的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株采集 供试菌种分离于五九七农场果园苹果树病疤，为避免染菌，菌种采集时，手术刀、剪刀等工具均以火焰灼烧方法灭菌，并用酒精棉擦拭手部和将采集的病变部位；将采集到的患病树皮病变部位放置于无菌培养皿中，带回实验室。实验室操作过程均为无菌操作。

1.1.2 枝条 枝条均采集于五九七农场果园苹果树上，为1年生的健康、新鲜枝条，直径控制在1.0~1.2 cm范围内，确保枝条长度、粗细均匀一致，用剪刀采集，采集后将枝条两端切口，以热熔石蜡密封，防止水分流失。

1.1.3 实验药品制备 实验选用抗真菌、毒副作用小、代谢残留少的丁香酚[7]及愈创木酚作为抑制剂，探究其对病原菌的抑制效果。愈创木酚抑制剂：以无菌水为溶剂，制备以下浓度的愈创木酚抑制剂：2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%、4.50%、5.00%、5.50%，保存备用；丁香酚抑制剂：以乙醇为溶剂，制备以下浓度的丁香酚抑制剂：0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%，保存备用。

1.1.4 培养基 实验选用基础培养基中PDA培养基；含抑制剂培养基：在PDA培养基中以1∶15（V/V）的比例添加不同浓度的抑制剂，配制含不同浓度抑制剂的PDA培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 病原菌分离 将患病部位树皮组织剪成边长5 mm左右的正方形，先将患病部位树皮组织块在体积分数为70%酒精溶液中浸泡20 s左右，无菌水冲洗1次，1 g/L HgCl溶液中消毒4 min，无菌水冲洗5次。处理后接在PDA固体培养基上，放在28 ℃培养箱中暗培养3~5 d后观察菌落生长情况。选取形态特征明显菌落进行继代培养，直至得到无污染、单一目标培养物为止。

1.2.2 病原菌致病力检测 参考张美鑫等[8]的室内快速检测方法。用灭菌的解剖刀、打孔器等处理未染病的新鲜枝条，进行枝条伤口接种操作，在25 ℃恒温条件下培养，4 d后测定其病斑长度。每一接种设置10个实验对照，实验重复3次。

计算公式：

1.2.3 病原菌抑制 选取培养7 d的菌株，在同心圆上裁取直径为8.5 mm的菌块，转接到含有愈创木酚、丁香酚抑菌剂的固体培养基上。以愈创木酚、丁香酚对应溶剂为对照组。每个梯度浓度进行3组平行实验，每24 h观察1次。整个试验重复3次。25℃恒温条件下培养4 d，观察记录菌丝生长情况。观察记录菌丝生长情况，整个试验重复3次。采用十字交叉法进行各组菌丝直径的确定，通过各组菌丝直径平均值±方差的方法进行菌丝直径的计算。抑制率通过计算公式[9]:

2 结果与分析

2.1 菌株培养特性

观察7 d内不同分离株在PDA培养基上的培养性状(如表1)，结果表明：各分离株在PDA培养基上均能生长，但培养特征存在差异。其中FA特征明显，菌落为黑色，且长势较快，7 d后观察，菌落直径达到88.2 mm，边缘呈羽毛状，产生黑色茂密气生菌丝。FB、FC、FD菌落特征相似，菌落初为白色，培养5 d后，菌落背面中心变为黄褐色，7 d后观察，FB菌落为黄褐色，边缘为放射状，直径达到80.7 mm，气生菌丝灰色稀少；FC菌落仍为黄褐色，呈现羽毛状边缘，直径达到85.4 mm，为白色稀少气生菌丝；FD菌落为深褐色，边缘为放射状，菌丝直径达到75.7 mm，气生菌丝灰色稀少。

表1 7 d后分离株在PDA培养基上的菌落特征

2.2 菌株致病力检测

致病力检测实验结果表明（见图1）：4种分离株均能使果树枝条患病，培养1 d后观察现象均为划痕变色，未见明显病斑。接种2 d后，FA、FB、FC在伤口处开始出现黄褐色病斑，但每一分离株的平均病斑长度存在差异，FB最为明显，FD无明显病斑。接种3 d后，FD病斑长势明显，涨幅最大，FA、FB涨势缓慢。培养4 d后观察（如表2），结果表明：FC分离株的致病效果最为明显，病斑直径可达2.56 cm，FA致病效果较差，病斑直径仅为1.27 cm，4种分离株接种后枝条的发病率分别为：43.33%、50.00%、76.67%、66.67%。4种分离株对果树均有致病效果，其中在4种分离株中FC致病力最高，FA致病力最小。

表2 4 d后各分离株致病率及病疤直径

图1 4种分离株致病力检测

2.3 愈创木酚的抑制效果

愈创木酚抑制剂对病原菌抑制试验结果见图2，结果表明：愈创木酚对FB及FD抑制效果最为明显，浓度为2.00%时可见其抑制效果，而浓度为2.00%的愈创木酚抑制剂对FA及FC均无抑制效果。浓度为2.50%时，对FC菌种具有抑制效果。愈创木酚浓度在3.00%~3.50%范围内，曲线增幅明显，表明愈创木酚抑制剂在3.00%~3.50%范围内，抑制效果显著提高。浓度在3.50%~5.00%范围内，对FA菌种的抑制效果增长缓慢。当愈创木酚浓度达到4.00%时，对FB、FC、FD菌种皆完全抑制，此时FA仍能生长。当浓度达到5.50%时，对4种菌株完全抑制。

2.4 丁香酚的抑制效果

丁香酚抑制剂对病原菌抑制试验结果见图3，结果表明：丁香酚对FA抑制效果最为明显，浓度为0.25%时可见其抑制效果显著，高达57.14%，丁香酚浓度在0.25%~0.50%时，对FC的抑制效果显著提高，对FA、FB、FD抑制效果增加较为缓慢。浓度在0.50%~1.00%范围内，对FD菌种的抑制效果提高显著，其余3种抑制效果增幅较小。当丁香酚浓度达到1.00%时，完全抑制FC菌株的生长，当浓度达到1.50%时，对FA、FD菌种皆完全抑制，此时对FB的抑制效果仍为较低水平。当浓度达到2.00%时，对4种菌株完全抑制。

图2 愈创木酚抑制剂对菌丝长度影响

图3 丁香酚抑制剂对菌丝长度影响

3 结 论

实验结果表明，分离出的4种苹果树腐烂病病原菌中， FC致病力最高，FA致病力最低，愈创木酚及丁香酚的抑制试验结果表明，愈创木酚的浓度达到5.50%时，可对4种病原菌进行全面抑制，而丁香酚浓度达到2.00%时就可达到同样效果。由此可以看出，丁香酚、愈创木酚作为抑制剂对苹果树腐烂病病原菌均有抑制效果，其中丁香酚的抑制效果优于愈创木酚。

实验选用丁香酚及愈创木酚作为抑制剂进行果树腐烂病病原菌的抑制试验，作为酚类物质，丁香酚及愈创木酚具有挥发效果好、残留量少、毒副作用小等突出特点，减少了对树木的损害及对环境的不利影响。野外实际应用过程中，因其实际环境与实验室环境存在差异，且丁香酚及愈创木酚具有挥发性，实际抑制效果与实验结果将存在较大差异，在此理论依据基础上，未来将对实际情况下的抑制条件进行具体研究。

[1] 韦洁玲. 苹果树腐烂病菌不同分离株致病性差异研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2009.

[2]陈策. 国外对于苹果树腐烂病、桃树腐烂病以及其他同类病害的研究近况[J]. 中国果树, 1980(S1): 68-77.

[3] 张满良. 农业植物病理学[M]. 西安: 世界图书出版公司, 1997.

[4] 马现成, 林茹, 任鹏辉, 等. 果树腐烂病影响因素与防治[J]. 生物灾害科学, 2015(4): 321-324.

[5] 林茹, 马现成, 王雪, 等. 黑龙江东部垦区苹果树腐烂病现状调查研究[J]. 安徽农业科学, 2016(3): 175-177.

[6]王彩霞, 张清明, 李桂舫,等. 苹果树腐烂病拮抗细菌菌株BJ1的鉴定及其抑菌作用[J]. 植物保护学报, 2012(5): 431-437.

[7] 孔晓军, 刘希望, 李剑勇, 等. 丁香酚的药理学作用研究进展[J]. 湖北农业科学, 2013(3): 508-511.

[8]张美鑫, 翟立峰, 周玉霞, 等. 梨腐烂病致病力的室内快速测定方法研究[J]. 果树学报, 2013(2): 317-322.

[9]张林才, 杨阿丽, 陈佰鸿, 等. 平果树腐烂病高效杀菌剂的筛选[J]. 草原与草坪, 2014(5): 85-91.

Separation, Detection and Suppression of Pathogenic Bacteria of Fruit Rot Disease in Heavy Frigid Regions in Northeast China

WANG Xue1, YU Jing-ni2, MA Xian-cheng2, LAN Ying1, ZHANG Yue-hua2*

(1. College of Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2. College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

To detect the pathogenic bacterium and inhibition effects of phenolic compounds on fruit rot disease in heavy frigid regions in Northeast China, this experiment was conducted. Taking the horticulture base of 597 Farm in Heilongjiang Province as a case, strains at the lesion were separated and isolated from diseased orchards to detect the pathogen virulence by using eugenol and guaiacol as inhibition agents, and to explore the inhibitory effects on pathogenic bacteria. Altogether 4 pathogenic bacteria of fruit rot disease were separated, which were recorded as FA、FB、FC、FD, and the pathogenicity test experiment were carried out on them. Results showed that FC had the highest inhibitory effect, with its lesion diameter up to 2.56 cm, and the effectiveness of pathogenicity up to 76.67%; FA’s lesion diameter was 1.27 cm, with its pathogenicity only 43.33%. The pathogenic effect of FC was the highest, and the pathogenic effect of FA was the lowest. Inhibition test results also showed that 4 pathogenic bacteria could be fully suppressed. When eugenol concentration reached 2.0%, the same effect could be achieved as when the concentration of guaiacol reached 5.5%. So, eugenol and guaiacol could be used as inhibitors against fruit rot disease, and the inhibitory effect of eugenol was superior to that of guaiacol.

heavy frigid region; fruit rot disease; pathogenic bacterium; virulence; inhibition test

S436.6

A

2095-3704（2016）04-0224-04

2016-09-24

黑龙江省教育科学“十二五”规划2015年度重点课题（GJB1215080）和佳木斯大学校长创新创业基金项目（xzyf2014-13）

王雪，本科生，主要从事环境生物学研究，272963208@qq.com；

张跃华，副教授，博士，主要从事农业微生物学研究，zhangyaohua_2008@163.com。