CXCL14在子宫内膜异位症增生期内膜中的表达

邹阮敏，林刻智，余霞，余剑琴，阮静瑶，陈冠阁，张文淼

（1.温州医科大学附属第一医院　妇产科，浙江　温州　325015；2.温州医科大学　基础医学实验中心，浙江　温州　325035；3.温州医科大学附属第一医院　病理科，浙江　温州　325015）



CXCL14在子宫内膜异位症增生期内膜中的表达

邹阮敏1，林刻智2，余霞3，余剑琴1，阮静瑶3，陈冠阁1，张文淼1

（1.温州医科大学附属第一医院妇产科，浙江温州325015；2.温州医科大学基础医学实验中心，浙江温州325035；3.温州医科大学附属第一医院病理科，浙江温州325015）

目的：分析CXCL14在子宫内膜异位症增生期在位内膜及异位内膜中的表达情况。方法：采取Real-time PCR和免疫组织化学染色法对手术和病理确诊增生期子宫内膜异位症的18例在位内膜、24例异位内膜及20例因行卵巢囊肿、子宫肌瘤手术的增生期正常子宫内膜（术后病理除外子宫内膜异位症）进行CXCL14表达的检测。结果：①与正常内膜比较，I I I-IV期子宫内膜异位症在位内膜的CXCL14 mRNA和蛋白表达水平明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；②与正常内膜比较，I-I I期子宫内膜异位症在位内膜的CXCL14 mRNA和蛋白表达水平有下调，但差异无统计学意义（P＞0.05）；③与I I I-IV期子宫内膜异位症在位内膜比较，I I I-IV期子宫内膜异位症异位内膜的CXCL14 mRNA和蛋白表达水平明显下调，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与I-I I期在位内膜比较，I-I I期异位内膜的CXCL14 mRNA和蛋白表达水平有下调，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：CXCL14可能参与子宫内膜异位症的发生、发展，可能与子宫内膜异位症患者妊娠率低有关。

CXCL14；子宫内膜异位症；正常内膜；在位内膜；异位内膜

子宫内膜异位症是一种妇科常见病，多见于育龄妇女，近年来发病率呈上升趋势。子宫内膜异位症在组织学上呈良性表现，但在临床行为学上具有类似恶性肿瘤的特点［1］。子宫内膜异位症更是不孕的主要原因，相关研究发现其直接降低了体外受精/卵细胞浆内单精子注射（IVF/ICSI）临床助孕的成功率。子宫内膜异位症患者的不孕、低妊娠率和内膜基因的异常表达紧密相关［2-5］。重度子宫内膜异位症患者在位内膜基因转录和信号通路发生极大的改变，异常的分子及功能可能导致内膜贫瘠，不宜于受精卵着床而降低受孕率，利用基因芯片比较重度与轻度子宫内膜异位症在位内膜基因表达的差异发现，CXCL14在分泌期呈显著改变［6］，而关于CXCL14在增殖期的表达未作描述。目前国际上极少关于CXCL14在子宫内膜异位症患者中的表达变化的研究，且意见不一致，为探讨CXCL14是否可能与子宫内膜异位症病情发展及下降的妊娠率有关，本研究选择CXCL14在子宫内膜异位症相关的不孕症患者增生期在位内膜及异位内膜中的表达情况进行分析。

1　材料和方法

1.1材料 Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；Re-verTra Ace反转录试剂盒、SYBR Master Mix（日本Toyobo公司）；DNase I、DEPC水（大连宝生物工程有限公司）；CXCL14特异性抗体I抗（英国Abcam公司）；羊血清封闭液、DAB显色液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔II抗（北京中杉金桥生物公司）；引物（上海英骏生物技术有限公司）。

1.2方法

1.2.1组织标本采集和处理：选取2014年6月-2015年12月温州医科大学附属第一医院妇产科手术和病理确诊增生期子宫内膜异位症患者为研究组，在位内膜标本18例，其中I-I I期8例，I I I-IV期10例，异位内膜标本24例，I-I I期9例，I I I-IV期15例，其中6例异位内膜标本没有同时留取在位内膜组织，其他均来自同一患者。同期因卵巢囊肿、子宫肌瘤行腹腔镜和开腹手术的增生期患者20例为对照组，均术中和病理除外子宫内膜异位症。入组患者均为生育期女性，年龄20～39岁，平均年龄27岁，在术前6个月内均未服激素类药物，月经周期的确定是根据患者的月经史，并由病理组织学证实。研究组患者均为不孕症患者，对照组生育功能正常，至少有1个子女。术中留取的标本（经病理确诊）均被分为2部分：一部分标本在手术切除后30 min，液氮冷冻保存，备RNA提取；另一部分由4%甲醛固定，经石蜡包埋、切片，行免疫组织化学检测。

1.2.2RNA的分离、纯化：总RNA的提取按Trizol试剂说明书进行。为增加小RNA得率，抽提的RNA，经DNase I处理，酚-氯仿抽提，最后DEPC水溶解纯化的RNA，检测RNA的浓度后，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 CXCL14 mRNA检测：参照ReverTra Ace反转录试剂盒说明，1 μL提取的RNA，以Oligo dT进行反转录。条件：42 ℃反转录60 min，75 ℃反转录15 min，结束后-2O ℃保存。Rea1-time PCR检测15 μL反应体系，包括：1×SYBR Green I Master-Mix，1 μL反转录产物，0.5 μmol/L特异反向引物，0.5 μmol/L特异前向引物。条件：95 ℃反应2 min，95 ℃反应15 s，60 ℃反应1 min，40个循环。使用仪器为Bio-Rad CFX96。所有标本均设3复孔。GAPDH为内参照，依照待测标本Ct值，转化为2-△Ct表示标本的CXCL14相对表达量，再2组间进行统计，其中△Ct=（CtCXCL14-CtGAPDH）。引物序列见表1。

表1　引物序列

1.2.4免疫组织化学检测及结果判定：甲醛固定、石蜡包埋子宫内膜、异位内膜组织，将组织蜡块切片，厚4 μm，多聚赖氨酸处理、二甲苯脱蜡、蒸馏水水化。过氧化氢室温孵育10 min，PBS冲洗3次；枸橼酸盐缓冲液高压1.5 min。冷却降温后，PBS冲洗3次；羊血清处理2 h；加入一抗，4 ℃过夜。加辣根过氧化物酶标记二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色。苏木素复染脱水封片。双盲法对结果进行判定：染色阳性的细胞比率分4个等级，阴性（-）、阳性细胞率＜10%（+）、阳性细胞率10%～50%（++）、阳性细胞率＞50%（+++）。用图像处理软件计算处理并进行统计分析。

1.3统计学处理方法 采用统计软件SPSS21.0进行分析。CXCL14表达比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1子宫内膜异位症在位内膜、异位内膜、正常内膜组织CXCL14 mRNA的表达 如图1A所示，CXCL14 和GAPDH的熔解曲线为单峰，提示我们建立的定量PCR方法能特异扩增目的基因。采用Real-time PCR的方法，检测轻度、重度增生期子宫内膜异位症组织和正常子宫内膜组织CXCL14 mRNA的表达（见图1B-C）：与正常内膜比较，I I I-IV期在位内膜的CXCL14 mRNA表达明显下调，差异有统计学意义（P ＜0.05）；I-I I期在位内膜的CXCL14 mRNA表达略有下调，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与I I I-IV期在位内膜比较，I I I-IV期异位内膜CXCL14 mRNA表达明显下调，且差异有统计学意义（P＜0.05）；I-I I期在位内膜和I-I I期异位内膜比较，CXCL14 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1　CXCL14 mRNA相对表达量比较

2.2子宫内膜异位症在位内膜、异位内膜和正常子宫内膜CXCL14蛋白表达的免疫组织化学分析 CXCL14蛋白在增生期子宫内膜异位症中，不同级别在位内膜、异位内膜组织和正常增殖期子宫内膜的表达见图2。阳性信号主要位于组织的腺体上皮细胞的胞浆中，而细胞核及细胞膜上无表达，在间质细胞弱表达。正常子宫内膜组织CXCL14表达呈强阳性、棕色染色，而I-I I期和I I I-IV期在位内膜组织表达逐步减弱；I-I I期和I I I-IV期异位内膜组织表达亦表现出明显的梯度下降，重度异位内膜几乎无表达，基本不染色。半定量分析结果显示，I I I-IV期在位内膜的CXCL14蛋白表达低于正常内膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05），I-I I期在位内膜的CXCL14蛋白表达也低于正常内膜，但差异无统计学意义（P＞0.05）；I I I-IV期异位内膜的CXCL14蛋白的表达水平明显较I I I-IV期在位内膜低，差异有统计学意义（P＜0.05），而I-I I期异内膜的CXCL14蛋白表达与I-I I期在位内膜比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

3　讨论

“异位种植学说”、“在位内膜学说”认为，逆流的经血中有活性的内膜细胞，通过黏附、侵袭、血管形成，种植于异位盆腔［7］，其发生是由在位内膜的特质性决定［8］。异位内膜细胞有增生、浸润、转移及复发等行为，侵袭周围组织，并在局部种植、生长和新生血管形成，疾病难以根治，复发率高［1］。生长因子和诱导细胞增殖、血管形成的细胞因子参与异位内膜的种植和生长过程，而且在子宫内膜异位症发病过程中发挥着重要作用［9］。研究表明，趋化因子与子宫内膜异位症有着密切的关联［10］，趋化因子在子宫内膜腺上皮及间质细胞黏附、侵袭、血管形成、发展为子宫内膜异位症过程中起了重要的作用［11］，但是趋化因子变化是否直接导致异位症发生，目前无确切依据。

CXCLl4作为一种新的基因普遍表达于人体脑、小肠、肾脏等处，能作为机体维持稳态的重要因素［12-13］。CXCLl4位于5p31.1染色体，前体有99个氨基酸残基，断裂除去一个由22个氨基酸组成的信号肽后，产生一个由77个氨基酸组成的成熟蛋白质［12］。CXCL14与其他趋化因子一样，参与调控免疫、炎症、血管形成、肿瘤、胚胎发育等许多病理生理过程［12，14-20］，可趋化单核细胞、巨噬细胞、未成熟树突状细胞、自然杀伤细胞和B细胞等多种免疫细胞［13，21-22］，也可通过减少血管平滑肌细胞趋化性及降低肿瘤微脉管系统形成从而抑制血管形成［19-20，23］。在多数肿瘤组织中CXCL14低表达，其沉默可能是癌症发生的关键，上调其表达成为抗肿瘤的研究重点［24］。在正常子宫内膜中，CXCL14在分泌中、晚期表达显著升高，其表达受孕激素调节，对自然杀伤细胞可能具有显著趋化作用［25］。另有文献报道，剔除老鼠中的CXCL14基因能显著下调妊娠密切相关的子宫内膜自然杀伤细胞增殖［26］。在妊娠早期，CXCL14表达于着床部位，与内膜的容受性和妊娠的建立有关［3］。

为研究CXCL14在子宫内膜异位症中的表达情况，本实验采用Real-time PCR和免疫组织化学的方法检测分析增生期子宫内膜异位症在位内膜、异位内膜、正常内膜组织。实验结果表明，在位内膜和异位内膜中CXCL14在I I I-IV期重度患者中表达明显下调，虽然在I-I I期轻度患者中亦有下调，但差异无统计学意义，CXCL14似乎能够反映子宫内膜异位症病情的严重程度。在先前研究［27］中，增殖期重度子宫内膜异位症患者CXCL14表达显著下调，研究者认为其表达降低与重度子宫内膜异位症患者在位子宫内膜细胞的黏附和增殖能力增强有关，同样提示CXCL14可能与子宫内膜异位症病情发展有关。但该项研究局限于在位内膜进行对比分析，没有同时检测异位内膜中CXCL14 mRNA和蛋白的表达情况，本研究对其作了适当的补充，且实验结果完全吻合。

图2　子宫内膜异位症在位内膜、异位内膜和正常子宫内膜CXCL14蛋白染色结果（×200）

图3　CXCL14蛋白相对表达量比较

一项对22个体外受精（in vitro fertilization，IVF）统计文献进行meta分析发现：重度子宫内膜异位症较轻度患者IVF成功率显著降低（13.84% vs 21.12%）；与轻度患者比较，患有重度子宫内膜异位症的妇女无论是自然还是人工周期，其妊娠率（22.6% vs 40.0%）、种植成功率（13.7% vs 28.3%）均显著降低［28］。有学者围绕重度子宫内膜异位症患者妊娠率下降的临床问题，采用基因芯片的方法在异位症相关的不孕症患者增殖期在位内膜中筛选出12种基因，再使用qRT-PCR进行定量分析，结果仅发现CXCL14下调表达，提示CXCL14表达下调可能与妊娠率下降有关［27］。本试验选择子宫内膜异位症相关的不孕症患者，CXCL14在增殖期重度异位症在位内膜、异位内膜组织中均为低表达，表明CXCL14与异位症不孕症之间有着极其密切的联系，CXCL14的异常表达很可能导致不孕，但仍需对其在分泌期的表达进行后续的研究，进一步深入了解两者之间的关联，其表达下调是否仅造成两者妊娠率之间的差异，是否与子宫内膜异位症其他生物学行为如：疼痛、盆腔粘连等相关目前尚不得而知。

本研究I-II期和III-IV期子宫内膜异位症中CXCL14表达显著不同，CXCL14下调，可能促进细胞黏附和增殖，活化在位内膜，促使细胞血管形成、侵袭，参与子宫内膜异位症的发生、发展过程；可能改变宫腔内微环境，不利于囊胚着床，导致妊娠率下降。综上所述，子宫内膜异位症相关的不孕症，也许可以通过调节CXCL14的表达而改变预后。CXCL14可能可以作为一项检测指标，从分子生物学角度判断异位症的严重程度和不孕的概率。

［1］郎景和.子宫内膜异位症研究的新里程[J].中华妇产科杂志, 2005, 40(1): 3-4.

［2］KAO L CGERMEYER ATULAC Set al.Expression profiling of endometrium from women with endometriosis reveals candidate genes for disease-based implantation failure and infertility［J］.Endocrinology2003144（7）2870-2881.

［3］KOVAL HCHOPIAK VKAMYSHNYI A.mRNA TLR2 and TLR4 expression in the endometrium tissue in women with endometriosis assosiated with infertility［J］.Georgian Med News2015（244-245）7-11.

［4］YANG HYIN JFICARROTTA Ket al.Aberrant expression and hormonal regulation of Galectin-3 in endometriosis women with infertility［J］.J Endocrinol Invest2016［Epub ahead of print］.

［5］ZHANG HZHANG ZLI Get al.Association of FCRL3 genetic polymorphisms with endometriosis-related infertility riskan independent study in Han Chinese［J］.Medicine （Baltimore）201594（35）e1168.

［6］AQHAJANOVA LGIUDICE L C.Molecular evidence for differences in endometrium in severe versus mild endometriosis［J］.Reprod Sci201018（3）229-251.

［7］BARTOSIK DJACOBS S LKELLY L J.Endometrial tissue inperitoneal fluid［J］.Fertil Steril198646（5）796-800.

［8］KOKS C AGROOTHUIS P GDUNSELMAN G Aet a1.Adhension of shed menstrual tissue in an in vitro model using amnion and peritoneuma light and electron microscopic study［J］.Hum Reprod199914（3）816-822.

［9］刘海元, 郎景和, 刘珠凤, 等.樊庆泊子宫内膜异位症患者在位内膜Stathmin的表达研究[J].生殖医学杂志, 2013, 9(22): 663-667.

［10］HOU ZSUN LGAO Let al.Cytokine array analysis of peritoneal fluid between women with endometriosis of different stages and those without endometriosis［J］.Biomarkers200914（8）604-618.

［11］王倩倩.子宫内膜异位症的机制及诊疗现状[D].苏州: 苏州大学, 2013.

［12］HROMAS RBROXMEYER H EKIM Cet a1.Cloning of BRAKa novel divergent CXC chemokine preferentially expressed in normal versus malignant cells［J］.Biochem Biophys Res Commun1999255（3）703-706.

［13］SLEEMAN M AFRASER J KMURISON J Get a1.B cell and monocyte-activating chemokine （BMAC）a novel non-ELR alpha-chemokine［J］.Int lmmunol200012（5）677-689.

［14］卢金昌, 王晋, 雍碧城, 等.趋化因子CXCLl4在骨肉瘤中的表达及其与预后的关系[J].南方医科大学学报, 2013, 33(6): 798-803.

［15］HAIBIN KQI CYING Zet al.The cytokine gene CXCL14 restricts human trophoblast cell invasion by suppressing gelatinase activity［J］.Endocrinology2009150（12）：5596-5605.

［16］TAKAHIKO HKOSUKE T.Pleiotropic functions of the CXC-type chemokine CXCL14 in mammals［J］.J Biochem，2012151（5）469-476.

［17］DARASH-YAHANA MGILLESPIE J WHEWITT S M，et a1.The chemokine CXCLl6 and its receptorCXCR6as markers and promoters of inflammation-associated cancers ［J］.PloS One20094（8）e6695.

［18］ZLOTNIK A.Chemokines and cancer［J］.Int J Cancer2006，119（9）2026-2029.

［19］ALLINEN MBEROUKHIM RCAI Let al.Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer［J］.Cancer Cell20046（1）17-32.

［20］MCCOLL S R.Chemokines and dendritic cellsa crucial alliance［J］.Immunol Cell Biol200280（5）489-496.

［21］KURTH IWILLIMANN KSCHAERLI Pet a1.Monocyte selectivity and tissue localization suggests a role for breast and kidney-expressed chemokine （BRAK） in macrophage development ［J］.J Exp Med2001194（6）855-861.

［22］CALON AESPINET EPALOMO-PONCE Set a1.Dependency of colorectal cancer on a TGF-β-driven program in stromal cells for metastasis initiation［J］.Cancer Cell，201222（5）571-584.

［23］SHELLENBERGER T DWANG MGUJRATI Met al.BRAK/CXCL14 is a potent inhibitor of angiogenesis and a chemotactic factor for immature dendritic cells［J］.Cancer Res200464（22）8262-8270.

［24］TESSEMA MKLINGE D MYINGLING C Met al.Reexpression of CXCL14a common target for epigenetic silencing in lung cancerinduces tumor necrosis［J］.Oncogene201029（37）5159-5170.

［25］NORFILZA MCHING-WEN CEMMA Cet al.Progestin regulates chemokine （C-X-C motif） ligand 14 transcript level in human endometrium［J］.Mol Hum Reprod2010，16（3）170-177.

［26］CAO QCHEN HDENG Zet al.Genetic deletion of Cxcl14 in mice alters uterine NK cells［J］.Biochem Biophys Res Commun2013435（4）664-670.

［27］HURST B SSHIMP K EELLIOT Met al.Molecular evaluation of proliferative-phase endometrium may provide insight about the underlying causes of infertility in women with endometriosis［J］.Arch Gynecol Obstet2014289（5）：1119-1124.

［28］KUIVASAARI PHIPPELAINEN MANTTILA Met al.Effect of endometriosis on IVF/ICSI outcomestage III/ IV endometriosis worsens cumulative pregnancy and liveborn rates［J］.Hum Reprod200520（11）3130-3135.

（本文编辑：丁敏娇）

Expression of chemokine CXCL14 in the proliferative-phase endometriosis

ZOU Ruanmin1LIN Kezhi2，YU Xia3YU Jianqin1RUAN Jingyao3CHEN Guan'ge1ZHANG Wenmiao1.1.Department of Obstetrics and Gynecologythe First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical UniversityWenzhou325015； 2.Medical Experimental Teaching CenterWenzhou Medical UniversityWenzhou325035； 3.Department of Pathologythe First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical UniversityWenzhou325015

ObjectiveTo analyze the expression of chemokine CXCL14 in the eutopic and ectopic endometrium of the proliferative-phase endometriosis.MethodsReal-time PCR and immunohistochemistry were adopted to measure and compare the CXCL14 expression in 18 cases of eutopic endometrium24 cases of ectopic endometrium and 20 cases of normal endometriumwhich were confirmed by surgery and pathology.Results：①Compared to normal endometriumthe expression of chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels significantly declined in eutopic endometrium with stage III-IVthere were significant differences （P＜0.05）.②Compared to normal endometriumthe expression of chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels declined slightly in eutopic endometrium with stage I-IIbut there were no significant differences.③The chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels were significantly down-regulated in ectopic endometrium with stage III-IV compared to eutopic endometrium with stage III-IV （P＜0.05）.④The chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels were slightly down-regulated in ectopic endometrium with stage I-II compared to eutopic endometrium with stage I-II.ConclusionOur findings indicated that CXCL14 may participate in the development and progression of endometriosiswhich is likely associated with the low conception rates in women with endometriosis.

CXCL14； endometriosis； normal endometrium； eutopic endometrium； ectopic endometrium

R711.71

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.007

2016-01-20

温州市科技局科研基金资助项目（Y20140308，Y2014 0216）；浙江省自然科学青年基金资助项目（LQ15C010002）。

邹阮敏（1981-），女，浙江温州人，主治医师，硕士。

张文淼，主任医师，硕士生导师，Email：zhwm63@126.com。