齐墩果酸抑制地佐环平诱导的小鼠精神分裂症的实验研究

陈德沈，刘立滢，陈策，张伟，林崇光

（温州市第七人民医院　精神科，浙江　温州　325000）



齐墩果酸抑制地佐环平诱导的小鼠精神分裂症的实验研究

陈德沈，刘立滢，陈策，张伟，林崇光

（温州市第七人民医院精神科，浙江温州325000）

目的：观察齐墩果酸在NMDA受体拮抗剂地佐环平（MK-801）诱导的小鼠精神分裂样行为中的作用。方法：小鼠口服给予齐墩果酸，观察MK-801诱导的小鼠精神分裂样行为反应，包括旷场实验、听觉惊吓反射（ASR）实验和新物体识别反应。结果：MK-801处理的小鼠在旷场实验中表现出过度的兴奋性运动，而单次给予齐墩果酸阻断了这一作用。齐墩果酸本身对小鼠ASR或前脉冲抑制（PPI）没有影响，却可以减轻MK-801诱导的前脉冲缺陷。在新物体辨识实验中，单次给予齐墩果酸同样可以逆转MK-801诱导的小鼠注意力和识别记忆损伤。此外，齐墩果酸抑制MK-801对前额叶Akt、GSK3β信号通路的激活。结论：齐墩果酸可以作为治疗严重精神分裂症如阳性症状、感觉门控失调、意识损伤的候选药物。

齐墩果酸；精神分裂；地佐环平；小鼠

精神分裂症牵涉到多巴胺能、谷氨酸能、氨基丁酸能神经传导异常［1-2］。大多数阻断多巴胺D2受体的抗精神类药物（经典的或非经典的）被批准用于治疗精神分裂症，但是这些药都存在各种不良反应，如锥体外症候群或代谢症候群［1］。有报道［3］指出夏枯草的提取物可以调控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）-糖原合成激酶（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）信号通路，逆转由地佐环平（MK-801）诱导的小鼠精神分裂样行为异常。为了进一步鉴别夏枯草提取物中的活性成分，我们成功分离出数种活性成分，包括齐墩果酸（3β-3-Hydroxyolean-12-en-28-oic acid）。齐墩果酸为五环三萜类化合物（见图1），广泛分布于可食用植物中，具有肝保护、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药用价值［4］，它的这些药理学作用多与其调控磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/GSK3β信号通路相关［5-6］。蛋白激酶Akt在维持细胞功能中发挥重要作用，包括细胞代谢、细胞周期、突触可塑性、形成记忆［7］。通过Thr308或Ser473磷酸化位点的磷酸化来激活Akt，并逐步激活下游信号分子，例如GSK3β［8］。GSK3β属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，参与调控糖代谢、生长发育、轴突可塑性等多种生理过程［9］。有报道［10］显示Akt/GSK3β不仅与精神分裂症的病理生理密切相关，而且是抗精神病治疗的重要靶点。综合先前研究的发现，我们推测齐墩果酸可能是通过调控Akt/ GSK3β信号轴起到抗精神病的作用。另有报道［11］指出单次给予N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体拮抗剂可以引起多种拟精神病症状，因此本研究中利用动物精神分裂症模型，从多方位研究了齐墩果酸在治疗精神分裂症中的新药理学活性。

图1　齐墩果酸结构式

1　材料和方法

1.1实验动物 所用ICR小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，雄性，25～30 g，6周龄，清洁级，实验动物合格证号：SCXK（沪）2010-001。本次动物实验经温州市第七人民医院实验动物伦理委员会审核批准。动物饲养于温州市第七人民医院实验动物中心，分笼饲养，自由采食饮水，温度保持在（23± 2）℃，湿度保持在（55±5）%，光照时间为早上7点至晚上7点。

1.2材料 齐墩果酸、MK-801、氯氮平购自美国Sigma公司；Akt抗体、GSK3β抗体购自Santa Cruz公司；AktpSer473抗体（pAkt）、GSK3β pSer9（pGSK3β）抗体购自Cell Signaling公司；其他分析纯化学试剂购自国药集团；小鼠旷场实验装置和新物体识别实验设备均购自上海欣软信息科技有限公司；动物听觉惊吓反射（auditory startle reflex，ASR）系统购自美国Coulbourn公司。

1.3给药方式 MK-801溶解于0.9%氯化钠溶液；齐墩果酸悬浮于含10% Tween 80的0.9%氯化钠溶液；阳性药氯氮平溶解于含有0.1 N HCl的0.9%氯化钠溶液中。实验中每组小鼠数量为10只。行为学测试前30 min腹腔注射0.2 mg/kg MK-801，以诱导小鼠精神分裂症模型。进行行为学实验和处死前1 h，分别灌胃给予齐墩果酸（3、10、30 mg/kg），对照组给予等体积含10% Tween 80的0.9%氯化钠溶液。进行行为学实验前30 min给予氯氮平（1 mg/kg）。

1.4旷场实验 小鼠旷场实验在41.5 cm×41.5 cm ×41.5 cm的反应箱中进行。每次实验前均用70%乙醇擦拭箱体。将小鼠放置于反应箱中央，摄像机监测30 min内的运动行为，以总移动距离来评判水平自主活动。在旷场实验前1 h给予小鼠齐墩果酸（3、10、30 mg/kg）或10% Tween 80的0.9%氯化钠溶液。MK-801在实验前30 min给予以诱发小鼠过度活动。氯氮平在实验前30 min给予。

1.5ASR实验 ASR和前脉冲抑制（prepulse inhibition，PPI）测试在动物ASR系统中完成。将小鼠放入隔音室中，刺激开始后每1 ms记录65次，以平均振幅作为ASR的评判指标。ASR测试由声音惊吓实验和非刺激实验组成。ASR测试结束后，PPI测试开始，分为3个实验类型，分别为单独的听觉反射刺激，即在40 ms内120分贝的强噪音刺激；前脉冲实验联合单独听觉反射刺激，即先给予20 ms 73、76、82、86分贝的前脉冲刺激，间隔80 s，再给予40 ms 120分贝强刺激；非刺激实验，即仅接受背景音刺激，PPI测试首尾给予5次120分贝的强刺激，中间随机给予10次前脉冲刺激或非刺激对照，平均刺激间隔为21 s（12～30 s）。实验开始前先让动物接受一段5 min 70分贝的适应性刺激。评价指标：PPI=（1-前脉冲联合惊反射刺激的反应幅度/单独惊反射刺激的反应幅度）×100，数值为0时表示无PPI，数值越大代表抑制程度越深。提前1 h给予小鼠齐墩果酸（3、10、30 mg/kg）或10% Tween 80的0.9%氯化钠溶液。MK-801在实验前30 min给予以引起小鼠感觉门控缺陷。氯氮平在实验前30 min给予。

1.6新物体识别实验 先对小鼠进行2 d每天10 min自由探索以熟悉环境，熟悉环境结束24 h后开始正式训练，有2个完全相同的物体（金属圆桶）于距盒壁8 cm处沿一方墙直线排开。小鼠自另外2个拐角之一放入盒内，在自由探索5 min后再被送回饲养笼内。待2 h间歇后，小鼠被再引入实验盒内进行实验期的自由探索。此时，将其中1个金属圆桶置换为塑料长方体（二者高度一致）并位于原位，而另一已熟悉过的金属圆桶被移至新物体相对的拐角以防止小鼠空间的偏倚。如果小鼠用它的鼻子在1 cm之内指向物体或触及鼻子则被视为探索行为。对熟悉物品的探索时间记为Tfamiliar；新物品记为Tnovel，同时计算分辨指数来评价小鼠对新物体的优先探索能力：（Tnovel-Tfamiliar）/（Tnovel+Tfamiliar）× 100。提前1 h给予小鼠齐墩果酸（3、10、30 mg/kg）或10% Tween 80的0.9%氯化钠溶液。MK-801在实验前30 min给予以引起小鼠记忆能力损伤。氯氮平在实验前30 min给予。

1.7蛋白免疫印迹实验 给予齐墩果酸（30 mg/ kg）后1 h处死正常小鼠和MK-801处理的实验组小鼠，分离大脑前皮层。在冰浴的Tris-HCl（20 mmol/L，pH=7.4）溶液中将组织研磨破碎成均质溶液。取15 mg总蛋白进行8% SDS-PAGE凝胶电泳，100 V 4 ℃转PVDF膜2 h，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，漂洗后用辣根过氧化物标记的二抗进行在37 ℃孵育1 h，以化学发光方式显色。使用Image J软件对条带进行灰度分析，先计算各样本磷酸化蛋白pAkt、pGSK3β占各自总蛋白的比重，再将各组平均值与对照组平均值进行归一化计算。

1.8统计学处理方法 采用Graphpad Prism 5.0软件进行数据分析。所有数据均以±s表示。行为学数据组间比较采用单因素方差分析或双因素方差分析。蛋白免疫印迹数据采用t检验或单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1齐墩果酸逆转MK-801诱导的活跃过度 我们首先用旷场实验检测了齐墩果酸是否会影响小鼠的基础运动能力。与对照组相比，3种浓度齐墩果酸组小鼠在每5 min间隔内的移动距离和30 min内的总移动距离差异无统计学意义（P＞0.05），见图2AB。氯氮平组与对照组相比差异也无统计学意义（P ＞0.05）。说明齐墩果酸和氯氮平对小鼠的基础活动能力没有影响。给予MK-801后，小鼠在每5 min间隔内的移动距离显著增加（P＜0.001），见图2C。而联合使用齐墩果酸或氯氮平可以阻断MK-801的刺激作用（P＜0.05），见图2C-D。

2.2齐墩果酸减弱由MK-801导致的PPI缺陷 齐墩果酸组的听觉反射幅度和前脉冲强度未见明显变化，氯氮平组也未引起听觉反射幅度的明显变化，见表1和图3A。因此，齐墩果酸和氯氮平对小鼠的震惊反应幅度和PPI并没有作用。当齐墩果酸和MK-801联用时，小鼠的听觉惊吓幅度显著降低（P＜0.05）；当氯氮平和MK-801联用时，小鼠的听觉惊吓幅度显著降低（P＜0.05）。给予MK-801显著加强了小鼠对120分贝的ASR强度，并且降低所有前脉冲刺激的PPI程度（P＜0.05），见表2和图3B。

图2　齐墩果酸对小鼠运动活力的影响

表1　各组小鼠的听觉惊反射幅度（n=10，±s）

表1　各组小鼠的听觉惊反射幅度（n=10，±s）

噪音量（分贝）　对照组　齐墩果酸组　氯氮平组3 mg/kg　10 mg/kg　30 mg/kg 80　15.06± 2.28　10.19± 4.55　8.28± 0.94　14.90± 3.06　10.58± 1.68 90　18.50± 3.37　13.94± 1.83　23.38± 6.63　15.67± 2.09　14.06± 2.77 100　47.86± 8.45　35.19± 8.40　53.56±12.21　25.61± 3.94　56.97±10.44 110　105.40±21.77　73.92±16.17　103.50±13.87　90.25±18.71　86.78±13.34 120　150.70±24.30　145.10±33.57　171.30±22.96　149.10±23.75　163.00±17.37

表2　MK-801处理后各组小鼠的听觉惊反射幅度（n=10，±s）

表2　MK-801处理后各组小鼠的听觉惊反射幅度（n=10，±s）

与对照组比：aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001

噪音量MK-801+氯氮平组3 mg/kg　10 mg/kg　30 mg/kg 80　15.06± 2.28　17.53± 2.87a10.19± 4.55c　8.28± 0.94c14.90± 3.06c10.58± 1.68c90　18.50± 3.37　50.50±11.25a13.94± 1.83c23.38± 6.63c15.67± 2.09c14.06± 2.77c100　47.86± 8.45　87.75±14.49a35.19± 8.40c53.56±12.21c25.61± 3.94c56.97±10.44c110　105.40±21.77　145.50±23.15a73.92±16.17c103.50±13.87c90.25±18.71c86.78±13.34c120　150.70±24.30　243.60±38.27a145.10±33.57c171.30±22.96b149.10±23.75a163.00±17.37c（分贝）　对照组　MK-801组　MK-801+齐墩果酸组

图3　齐墩果酸对小鼠PPI的影响

2.3齐墩果酸对MK-801诱导的记忆损伤的修复作用 我们首先验证了齐墩果酸是否会影响正常小鼠的预判能力。在5 min内让各组小鼠分别对2个相同的物体进行探索，记录下小鼠对每个物体的嗅探时间，见图4A。2 h后，再将小鼠放置入识别箱，此时已经将其中1个旧物体替换为新物体，记录5 min内小鼠对2个物体的嗅探时间，见图4A。与对照组相比，齐墩果酸组小鼠在嗅探新旧物体的时间长度比例、分辨比及总探索时间差异无统计学意义。与齐墩果酸一样，给予药氯氮平对正常小鼠的预判能力也没有产生影响，见图4B-D。

给予MK-801后，小鼠嗅探新旧物体的时长比例和分辨比都产生了显著性影响。与对照组相比，给予MK-801后的实验组小鼠对新物体的嗅探时间比例和对新旧物体的分辨比显著下降，说明记忆有损伤。而给予齐墩果酸可以明显改善MK-801造成的各组小鼠记忆损伤，差异有统计学意义，见图4E-F。

2.4齐墩果酸抑制MK-801诱导的Akt、GSK3β磷酸化水平升高 齐墩果酸（30 mg/kg）不引起正常小鼠前皮层Akt、GSK3β的磷酸化水平，见图5A。根据前期研究［3］发现，MK-801明显上调了小鼠皮层Akt、GSK3β的磷酸化水平，这与MK-801能够诱导小鼠产生急性拟精神病样的作用相关。本研究中，MK-801也显著增加了小鼠前皮层Akt Ser473磷酸化位点、GSK-3β Ser9磷酸化位点的磷酸化程度（P＜0.05），见图5B。而齐墩果酸（30 mg/kg）抑制了MK-801所引起的Akt、GSK3β磷酸化水平升高，结果差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，MK-801和齐墩果酸对前皮层总Akt和GSK3β水平均不产生影响。

图4　齐墩果酸对小鼠识别记忆能力的影响

3　讨论

阳性症状与精神分裂症患者的多巴胺能系统和谷氨酸能系统间的平衡有密切关系［12］。单次给予MK-801可诱导小鼠在旷场实验中过度运动行为，其作用可被齐墩果酸（30 mg/kg）或D2/5-HT2A受体拮抗剂氯氮平所阻断［13］。此外，齐墩果酸不影响正常小鼠在旷场中的运动表现，但是对MK-801所导致的过度运动有抑制作用，而且并不是因为齐墩果酸有镇静或催眠作用。

惊吓反射的PPI是目前在各哺乳动物种系中所公认的一种SG模型［14］。大量研究表明在精神分裂症患者和动物模型中惊吓反射的PPI受到破环。在本研究中，齐墩果酸或氯氮平对正常小鼠的ASR和PPI幅度均没有作用，说明齐墩果酸或氯氮平不影响感觉门控功能。而单次给予MK-801即导致小鼠PPI缺陷，说明感觉运动门控受到破坏，而齐墩果酸可能具有改善精神分裂症患者感觉运动门控功能损伤的作用。

啮齿动物对新物体的识别记忆被认为与人类的陈述性（情景）记忆类似，而精神分裂症患者的此功能异常。本研究发现，MK-801诱导的识别记忆损伤可被齐墩果酸和氯氮平所逆转，并且单独给予齐墩果酸不影响正常动物的注意力和识别记忆功能，暗示齐墩果酸可能有助于提高精神分裂症患者的认知功能。

有报道［15］指出亚慢性给予齐墩果酸展示出抗抑郁样作用，可能影响了儿茶酚胺代谢。有文献［16］报道给予大鼠精神兴奋剂，如多巴胺受体激动剂、5-HT受体激动剂和NMDA受体拮抗剂，都会引起Akt 或GSK3β的磷酸化升高。我们发现MK-801引起的前皮层Akt和GSK3β磷酸化程度升高可以被单次给予齐墩果酸所抑制。也有报道［17］表明其他抗精神病药物也有同样的作用。此外，由于齐墩果酸处理的正常小鼠前皮层Akt和GSK3β磷酸化水平不变，因而我们推测齐墩果酸干预MK-801介导的的生化改变可能是针对于NMDA受体信号通路异常变化。

综上所述，我们发现齐墩果酸对MK-801诱导的小鼠精神病样行为有改善作用，例如自发活动过度活跃、PPI缺陷和新物体识别记忆损伤等，其机制与抑制MK-801诱导的前皮层Akt和GSK3β信号通路异常磷酸化有关。这些研究发现齐墩果酸是治疗精神分裂症阳性症状和认知症状的新型候选药物。

图5　齐墩果酸对小鼠前皮层Akt和GSK3β磷酸化水平的影响

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（本文编辑：吴昔昔）

Oleanolic acid attenuates MK-801-induced schizophrenia-like behaviors in mice

CHEN DeshenLIU Liying，CHEN CeZHANG WeiLIN Chongguang.Department of PsychiatryWenzhou Seventh People's Hospital，Wenzhou325000

ObjectiveTo observe the effects of oleanolic acid on schizophrenia-like behaviors in mice elicited by MK-801an N-methyl-D-aspartate （NMDA） receptor antagonist.MethodsEffects of oleanolic acid via oral gavage in MK-801-induced schizophrenia-like response in micesuch as open field testacoustic startle response test and novel object recognition test were all observed.ResultsSinglely administration of oleanolic acid blocked MK-801-induced hyperlocomotion in the open field test.In acoustic startle response testoleanolic acid did not affect the acoustic startle response or prepulse inhibition （PPI） level.And MK-801-induced PPI deficit was ameliorated by oleanolic acid.In novel object recognition testattention and recognition memory impairments induced by MK-801 were reversed by oleanolic acid.Additionallyoleanolic acid normalized the MK-801-induced alterations of signaling moleculesincluding phosphorylation levels of Akt and GSK-3β in frontal cortex.ConclusionThese results suggest that oleanolic acid can be a candidate for the treatment of several symptoms of schizophreniaincluding positive symptomssensorimotor gating disruptionand cognitive impairments.

oleanolic acid； schizophrenia； dizocilpine； mice

R749.3

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.008

2016-01-27

陈德沈（1974-），男，浙江温州人，主治医师。