Th17/Treg细胞在支气管哮喘患者外周血中的表达

王君丽徐彦飞李小莉徐晓妮皮丹

Th17/Treg细胞在支气管哮喘患者外周血中的表达

王君丽①徐彦飞②李小莉①徐晓妮②皮丹②

目的：探讨Th17/调节性T细胞（Treg细胞）在支气管哮喘患者外周血中的表达及意义。方法：收集30例正常对照组，30例确诊支气管哮喘患者（哮喘组）在急性发作期及缓解期外周血，分别检测Th17/Treg细胞的表达情况。结果：支气管哮喘患者急性发作期间Th17较正常对照组明显升高，而Treg细胞比例明显下降，支气管哮喘缓解期上述异常指标均趋于正常，但比正常对照组仍有明显改变（P<0.05）。Th17、Th17/Treg与支气管哮喘患者ACQ评分呈正相关（P<0.05），Treg与ACQ评分呈负相关（P<0.05），但Th17和Treg之间无明显相关性（P>0.05）。结论：在支气管哮喘患者体内的存在Th17及Treg细胞的平衡失调，可能参与疾病的进展，成为免疫调节治疗的靶点。

支气管哮喘； TH17； 调节性T细胞

支气管哮喘（简称哮喘）是最常见的呼吸道慢性疾病之一，近年来支气管哮喘的发病有上升趋势，随着全球哮喘防治创议（GINA）指南的全面推广，哮喘的防治较之前取得了很大的进展，但依然不能得到根治，仍有部分患者未经规范化治疗，给患者和社会造成沉重的医疗负担，严重影响患者生活质量。这一现状促使医学工作者对哮喘的发病机制和干预措施需作进一步地研究，从而找到新的治疗靶点和方法。目前Th17/Treg细胞失衡作为免疫性疾病的发病机制已受到研究人员的重视[1]。本研究针对支气管哮喘外周血中Th17/Treg细胞失衡进行研究，旨在为临床治疗重症和难治性哮喘提供新的治疗靶点，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1-12月于深圳市南山医院门诊就诊的已确诊为支气管哮喘的患者30例（含吸入糖皮质激素者），排除标准：（1）在抽血前3个月内未使用口服或静脉糖皮质激素者；（2）合并肺部其他疾病者；（3）合并严重心肝肾脏等其他系统疾病者。另择同期于深圳市南山医院进行健康体检的职工30例作为正常对照组，分别抽取两组受试者2 mL×3支EDTA抗凝血。两组一般年龄和性别比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。本研究经本医院伦理委员会批准同意且患者均签署知情同意书。

表1　两组一般资料比较（±s） 例（%）

表1　两组一般资料比较（±s） 例（%）

性别组别　年龄≥50岁　<50岁　男　女哮喘组（n=30）　8（42.1） 22（53.7） 11（45.8） 19（52.8）对照组（n=30）　11（57.9） 19（46.3） 13（54.2） 17（47.2）字2值　0.580　0.792 P值　>0.05　>0.05

1.2方法

1.2.1血浆及外周血单个核细胞（PBMC）的准备 取两组受试者的抗凝血6 mL，其中2 mL离心后，取上层血浆，置-80 ℃冰箱保存备用，其余部分用PBS液1∶3稀释备用。将淋巴细胞分离液加入离心管内，将稀释好的外周抗凝血缓慢加在上层，2000 r/min×30 min离心，用吸管轻轻将PBMC层细胞缓慢吸出，用PBS缓冲液低温离心洗涤PBMC 3次。查看细胞活力，确保活力大于95%，用含有10%胎牛血清的RDMI 1640培养基重悬细胞备用。

1.2.2PBMC Th17细胞的标记 在PBMC培养基中分别加入莫能霉素、离子霉素及PMA，孵箱内培养6 h，取出细胞进行标记，分别标记CD4-FITC，IL-17-PE，CD25-APC，每种标记均设置阴性同型对照，相关试剂均购自eBioscience USA公司，按照说明书操作。

1.2.3外周血Treg细胞的标记 直接取收集的外周血进行CD4、CD25表面抗原的标记，标记好的细胞破膜后进行Foxp3及其同型对照的标记，每种标记均设置阴性同型对照，相关试剂均购自eBioscience USA公司，按照说明书操作。

1.2.4流式细胞术分析标记好的PBMC 流式细胞仪为美国Beckman-Coulter公司产品，以前向角（FS）和侧向角（SS）散点图设门区分PBMC，对门内CD4+的T淋巴细胞进行分析，每管收集1×104个细胞，分析CD25+Foxp3+细胞和IL-17+细胞在CD4+细胞中的比例。使用EXPO32 ADC Analysis 软件分析结果。

1.2.5随诊要求 支气管哮喘患者在慢性持续期随诊时，要求完成ACQ评分，在评分前需由经治医生详细讲解表格内容。

1.3统计学处理 使用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，相关分析比较采用线性相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1外周血Th17/ Treg细胞检测结果 支气管哮喘急性发作期患者外周血Th17比例较正常对照组明显升高，在恢复后即处于慢性持续期时较急性发作期明显下降；Treg在急性发作期明显下降，而在慢性持续期时又明显上升，比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2　外周血Th17/Treg细胞检测结果（±s）

表2　外周血Th17/Treg细胞检测结果（±s）

*与对照组比较，P<0.05；△与急性发作期比较，P<0.05

组别　Th17　Treg　Th17/Treg正常对照组（n=30）　2.09±0.31　8.39±1.54*0.26±0.05*△急性发作期（n=30）　2.54±0.23　6.03±1.31*0.44±0.11*△慢性持续期（n=30）　2.26±0.28　7.44±1.68*0.32±0.09*△

2.2慢性持续期支气管哮喘患者ACQ评分与Th17/ Treg相 关 性 分 析 Th17、Th17/Treg与ACQ评分 均 呈 正 相 关（r1=0.445，P1=0.014；r2=0.468，P2=0.009），Treg与ACQ评分呈负相关（r=-0.407，P=0.026），Th17与Treg之 间 无 明 显 相 关 性（r=-0.339，P=0.067）。

3　讨论

支气管哮喘发病机制比较复杂，目前尚未完全明确，经典理论认为气道的炎症机制是其中最主要的机制，T细胞介导的免疫失衡在其中起到了关键作用，辅助性T细胞1型（Th1）/辅助性T细胞2型（Th2）细胞失衡已明确在支气管哮喘发病起重要作用，但目前很多研究证实支气管哮喘的发病机制不能用单纯的Th1/Th2细胞失衡来解释[2-3]。研究证实Th17、调节性T细胞及其代表性细胞因子IL-17、IL-10等在免疫系统疾病的发病机制中起到重要作用，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等疾病[4-5]。文献[6-7]指出在儿童哮喘中，也存在Th17/Treg的平衡失调，本研究以成人支气管哮喘为研究对象，主要研究支气管哮喘外周血是否存在Th17/Treg免疫失衡，及其与疾病严重程度之间的关系。

首先笔者发现在成人支气管哮喘患者急性发作期间Th17比例较正常对照组明显升高，而Treg细胞比例明显下降，这与之前在儿童哮喘中的研究结果一致，本研究还发现在支气管哮喘缓解期，上述异常升高或下降的指标均趋向正常。这说明Th17/ Treg免疫失衡在支气管哮喘的急性发作中起到了关键的作用。

Th17细胞通过免疫调节在支气管哮喘的炎症反应中起到重要作用。首先通过分泌IL-17，诱导上调IL-8的分泌，从而引起中粒细胞在气管内的聚集，并介导气管的炎症反应。Cheung等[8]的研究表明，Th17细胞还可以通过分泌IL-17作用于嗜酸性粒细胞，刺激嗜酸性粒细胞释放化学介质，增强炎症反应。有研究表明在重症哮喘的肺泡灌洗液及血浆中，儿童哮喘患者的外周血中均可检测到升高的Th17细胞和IL-17细胞因子，在动物实验中，有研究表明IL-17R缺失的小鼠不能被OVA激发成哮喘[9-10]。各种致敏原用不同方法诱导的哮喘动物模型中，大多提示IL-17具有重要作用[11]。本文研究结果表明在成人支气管哮喘疾病中，Th17细胞比例明显升高，且与疾病的严重程度之间存在着正相关，与前人的研究结果一致。

Treg细胞是机体重要的免疫调节机制，可以负反馈调节T细胞活化引起的免疫反应，从而使其不会因过度免疫对机体造成损伤。国内外许多研究证实在儿童哮喘和哮喘重症患者外周血中的CD4+CD25+Treg细胞的数量和功能均受到抑制，主要表现为哮喘患者体内的Treg细胞的FoxP3 mRNA表达下降，且分泌IL-10和TGF-β水平显著下降[6，12]。因此推测Treg细胞可能参与哮喘气道炎症的发生。本研究结果亦表明在成人支气管哮喘患者体内也存在CD4+CD25+FoxP3+Treg数量的下降，与国内外的研究结果一致，并证实Treg细胞的抑制与疾病的严重程度之间存在相关性。

由此可见，Th17及Treg细胞在支气管哮喘体内均有数量的异常，但是它们之间是否存在有相关性呢？本研究也对支气管哮喘患者在哮喘慢性持续期的两个指标之间进行了相关性分析，结果表明两者之间并不存在明显的相关性，该结果与之前在儿童哮喘体内的发现并不一致，考虑因为支气管哮喘是一个复杂的免疫疾病，各种细胞和细胞因子之间作用错综复杂，仅仅几个细胞亚群或细胞因子来解释其免疫失衡远远不够[13]。

本研究的结果表明，在支气管哮喘患者外周血中确实存在Th17及Treg细胞的免疫紊乱，可能为支气管哮喘的治疗提供新的靶点。

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Expression of Th17/Treg Cells in Peripheral Blood of Patients with Bronchial Asthma

WANG J un-li，XU Yan-fei，LI Xiao-li，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（24）：117-119

Objective：To investigate the expression of Th17/Treg cells in peripheral blood of patients with bronchial asthma.Method：A total of 30 cases of normal control group and 30 cases diagnosed with bronchial asthma in acute attack and remission of peripheral blood were collected，the expression of Th17/Treg cells were detected respectively.Result：Th17 in patients with bronchial asthma during acute attack was significantly higher than that in normal control group，the proportion of Treg cells decreased significantly，in the remission stage of bronchial asthma，the abnormal indexes tended to be normal，but there was still a significant change compared with the normal control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Th17，Th17/Treg were positively correlated with bronchial asthma patients ACQ score（P<0.05），Treg was negatively correlated with ACQ score（P<0.05），but there was no significant correlation between Treg and Th17（P>0.05）.Conclusion：Th17/Treg cells in patients with bronchial asthma may be involved in the progression of disease，become the target of immune regulation therapy.

Bronchial asthma； TH17； Regulatory T cells

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.24.033

2016-05-18） （本文编辑：李颖）

①南方医科大学深圳医院 广东 深圳 518101

②广东医学院附属南山医院

王君丽

First-author’s address：Shenzhen Hospital of Southern Medical University，Shenzhen 518101，China