蛹虫草对紫外辐照果蝇子代生长发育的影响

李尽哲，黄雅琴,2，叶兆伟

(1.信阳农林学院生物与制药工程学院，河南 信阳 464000； 2.郑州大学, 河南省离子束生物工程重点实验室，河南 郑州 450052)

蛹虫草对紫外辐照果蝇子代生长发育的影响

李尽哲1，黄雅琴1,2，叶兆伟1

(1.信阳农林学院生物与制药工程学院，河南 信阳 464000； 2.郑州大学, 河南省离子束生物工程重点实验室，河南 郑州 450052)

为了研究蛹虫草对果蝇的紫外辐照保护作用，以不同质量分数的蛹虫草人工饲料饲养经不同时间紫外辐照的果蝇，观察统计其子代的生长发育期及发育特征。研究发现，蛹虫草粉质量分数为0.2 %的人工饲料能有效缩短紫外辐照果蝇子代的全发育周期(P<0.01)，该人工饲料也能使紫外辐照40 min果蝇的子代性别比和畸变率均降低(P<0.01)、体长增加(P<0.05)、飞翔率升高(P<0.05)。蛹虫草粉质量分数为0.4 %的人工饲料不仅能使紫外辐照40 min果蝇的子代全发育周期缩短(P<0.01)，还能使紫外辐照20 min果蝇的子代的性别比和畸变率均降低(P<0.01)、体长增加(P<0.01)。由此可见，适宜质量分数的蛹虫草粉能够修复辐照损伤，对机体起到抗紫外保护作用。

蛹虫草；紫外辐照；果蝇；生长发育期；子代发育

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)为子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Ciavieps purpurea (Fr.)Tul.)、虫草属(Cordyceps)的模式种，又名北冬虫夏草、北虫草等。它含有大量的虫草素、虫草酸、虫草多糖[1]，是国际医学公认的人体免疫增强剂，能提高肝脏解毒能力，还能清除自由基、扩张血管、消除黄褐斑，抗衰防皱[2]。现有的众多研究也表明，多糖具有免疫调节、抗辐射、抗突变、抗衰老等多种药理作用，多糖正作为一种天然有效的辐射防护剂被人们所关注[3]。

紫外线是一种由原子的外层电子受到激发后产生的电磁波，过量的紫外线照射能够诱发白内障，使皮肤老化粗糙[4-8]。已有研究表明，紫外线能对亚油酸[9]、脂质体[10]、小白鼠血液免疫酶[11]、家兔皮肤[12]产生氧化性损伤。在真菌中，前人已研究过灰树花[13]、香菇[14]、灵芝[15]、肉色迷孔菌[16]、银耳[17]、滑子菇[18]的抗辐射保护作用，对于蛹虫草，前人只做过体外抗氧化分析[19-20]和小鼠的抗氧化酶活性研究[21]，然而，将蛹虫草作为抗辐射保护剂的开发探索，目前在国内还是空白，它能否抗紫外线辐射以及抗辐射效果如何都有待探索。果蝇(Drosophilamelanogaster)因其生活史短、易饲养、繁殖快、染色体少、突变型多，而成为一种模式生物，其许多代谢途径、生理学功能和发育阶段同哺乳动物基本相似，因此利用果蝇来进行抗辐射研究将对该领域有重要的理论和应用意义。本试验研究了蛹虫草对辐射处理后的果蝇子代生长发育周期、性别比、体长、飞翔率、畸变率的影响，旨在为蛹虫草作为辐射保护剂的开发利用提供科学的参考。

1 材料与方法

1.1材料

野生型果蝇(Drosophilamelanogaster)由信阳师范学院生命科学学院遗传学教研室提供。蛹虫草(Cordycepsmilitaris)采自信阳农林学院应用真菌实训基地。样品的制备：将蛹虫草40 ℃烘12 h至恒重，粉碎后过筛备用。

试剂：乙醇(99 %)、琼脂粉、蔗糖、丙酸、酵母粉、乙醚，试剂均为国产分析纯。

仪器：紫外透射反射仪(上海康华生化仪器制造有限公司ZF系列)、电子天平、恒温干燥箱、DNP-9052型电热恒温培养箱、显微镜、电炉、烧杯等。

1.2方法

基本人工饲料按照每100 mL蒸馏水中添加玉米粉11.2 g、蔗糖8.9 g、琼脂1.0 g、丙酸0.8 mL、干酵母粉1.0 g的比例配制。设基本人工饲料为对照(CK)，在CK的基础上配制不同质量分数的蛹虫草处理人工饲料，使蛹虫草粉终质量分数为0.1%、0.2%、0.4%，分别命名为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。收集8 h内羽化的未交配的果蝇，乙醚麻醉后区分雌雄，分开培养，3 d后进行紫外辐照。紫外透射反射仪的波长为302 nm，辐照根据时间长短分0、20、40 min共3个剂量，不分强度，然后转移到基本人工饲料和3个处理人工饲料中，先在培养箱中(25±1) ℃暗培养48 h，再在光照培养箱(温度为(25±1) ℃、自然光照、相对湿度50%～70%)中培养，3 d后放飞亲本，观察记录子代果蝇从产卵到羽化成蝇，每一生长阶段所经历的时间。卵期指从培养基表面出现卵到观察有1龄幼虫止的时间段；幼虫期指从出现1龄幼虫到出现蛹的时间段；蛹期指从出现蛹到出现成蝇的时间段；羽化期指从出现第1只成蝇到不再有成蝇羽化出所经历的时间段；全发育周期指从培养基表面出现卵到不再有成蝇羽化出所经历的时间段。收集子代果蝇，麻醉后在显微镜下观察其表型，统计其体长、性别比和畸变率。苏醒后继续培养，饲养40 d后，在室外逐个放飞，凡能起飞的，计入“可飞翔”组内，计算各组飞翔比率。所有试验均重复3次，结果用SPSS 13.0数据处理软件对试验数据进行T-test，分析差异显著性(0.001≤P<0.01表明差异极显著；0.01≤P<0.05表明差异显著；P>0.05表明无显著差异)。

2 结果与分析

2.1蛹虫草对紫外辐照果蝇子代发育期的影响

观察果蝇经紫外辐照后在蛹虫草人工饲料上产下的子一代的生长发育周期，结果如图1～图3所示。由图1可见，将未经过紫外辐照的果蝇饲养在Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 3种不同质量分数的蛹虫草人工饲料上，人工饲料Ⅰ上的子代仅卵期延长，幼虫期、蛹期、羽化期和全发育周期均缩短，其中与CK相比，全发育周期缩短1.16 d (P<0.01)；人工饲料Ⅱ上的子代卵期、幼虫期和全发育周期缩短，蛹期和羽化期延长，其中与CK相比，卵期缩短0.4 d(P<0.01)，全发育周期缩短0.92 d(P<0.05)；人工饲料Ⅲ上的子代卵期、羽化期和全发育周期缩短，幼虫期和蛹期延长，其中与CK相比，卵期和羽化期分别缩短0.36、0.56 d(P<0.01)，蛹期延长0.31 d(P<0.05)。

发育期12 h以下计为0.5 d，12 h以上记为1 d。每一生长阶段均为各个处理人工饲料与相应的基本人工饲料进行T-test。 “*”表示差异显著(P<0.05); “**”表示差异极显著(P<0.01)。下同。

The growth stage under 12 h,was marked as 0.5 d, and above 12 h,was marked as 1 d.The T-test was conducted between each treated artificial feed and corresponding basic artificial feed samples in each growth stage.“*”indicated significant difference (P<0.05);“**”showed extremely remarkable difference(P<0.01).The same as below.

图1蛹虫草对未辐照果蝇子代发育期的影响
Fig.1CordycepsmilitariseffectonDrosophilaoffspringgrowthstageswithoutUVradiation

由图2可见，将经过紫外辐照20 min的果蝇饲养在基本人工饲料上，其子代的各个发育期均延长，与未辐照基本人工饲料相比，卵期、幼虫期和羽化期分别延长0.29、0.56、0.52 d(P<0.05)，蛹期和全发育周期分别延长0.64、1.52 d(P<0.01)。将经过紫外辐照20 min的果蝇饲养在Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 3种不同质量分数的蛹虫草人工饲料上，与虽辐照20 min却饲养在基本人工饲料上相比，每种人工饲料上的子代其卵期、幼虫期、蛹期、羽化期和全发育周期均缩短，人工饲料Ⅱ上的子代发育期缩短最明显，其中卵期、幼虫期和全发育周期分别缩短0.36、0.57、2.35 d(P<0.01)。

每一生长阶段的基本人工饲料均与图1中相应的基本人工饲料进行T-test。下同。

The T-test was conducted between basic artificial feed samples of each growth stage and corresponding basic artificial feed samples in FIG.1.The same as below.

图2蛹虫草对紫外辐照20min果蝇子代发育期的影响
Fig.2CordycepsmilitariseffectonDrosophilaoffspringgrowthstagesafter20minUVradiation

由图3可见，将经过紫外辐照40 min的果蝇饲养在基本人工饲料上，其子代的各个发育期也均延长，与未辐照基本人工饲料相比，卵期、幼虫期和全发育周期分别延长1.27、1.52、3.42 d(P<0.01)，蛹期延长0.52 d(P<0.05)。将经过紫外辐照40 min的果蝇饲养在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3种不同质量分数的蛹虫草人工饲料上，与虽辐照40 min却饲养在基本人工饲料上相比，人工饲料Ⅱ和Ⅲ上的子代其全发育周期分别缩短2.09、2.31 d(P<0.01)。值得注意的是，3种人工饲料上的子代其幼虫期均延长，人工饲料Ⅱ和Ⅲ分别延长1.1、1.45 d (P<0.01)。在观察中还发现，这2组试验，幼虫生长缓慢，有的能顺利进入蛹期，有的死亡，因此，虽然顺利完成一个正常生长发育周期的子代全发育周期比对照短，但是子代生成量却比对照少。

可见，紫外辐照延长了果蝇子代生长发育期。利用蛹虫草培养紫外辐照果蝇，子代生长发育期缩短，这可能是因为蛹虫草能够提高机体内的抗氧化酶活性，修复短时间辐射所产生的氧化损伤，而长时间的紫外辐照产生的遗传损伤较大较多，蛹虫草对这些损伤的修复能力弱，才出现幼虫期延长，子代生成量少的情况。

图3 蛹虫草对紫外辐照40 min果蝇子代发育期的影响Fig.3 Cordyceps militaris effect on Drosophila offspring growth stages after 40min UV radiation

2.2蛹虫草对紫外辐照果蝇子代生长发育特征的影响

观察果蝇子代的性别比、体长、飞翔率和畸变率等生长发育特征，结果如表1所示。由表1可见，将经过紫外辐照20 min和40 min的果蝇饲养在基本人工饲料上，子代均出现性别比升高、体长减少、飞翔率降低、畸变率升高的现象。与CK相比，辐照40 min的果蝇在这4项指标上均差异达极显著性水平，畸变率高达5.87 %。

表1 蛹虫草对紫外辐照果蝇子代生长发育特征的影响Table 1 Cordyceps militaris effect on Drosophila offspring growth characteristics after UV radiation

注：*表示差异显著(P<0.05); **表示差异极显著(P<0.01)。

Note: *indicates significant difference (P<0.05);**shows extremely remarkable difference(P<0.01).

将未经过紫外辐照的果蝇饲养在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种不同质量分数的蛹虫草人工饲料上，3种人工饲料上的子代均出现性别比降低、飞翔率升高的现象。与CK相比，人工饲料Ⅱ上的子代性别比和体长差异达显著性水平，飞翔率增加19.8 %(P<0.01)，畸变率降低0.47 %(P<0.01)。

将经过紫外辐照20 min的果蝇饲养在3种不同质量分数的蛹虫草人工饲料上，与虽辐照20 min却饲养在基本人工饲料上相比，每种人工饲料上的子代均出现性别比降低、体长增加、畸变率降低的现象。人工饲料Ⅲ上的子代除了飞翔率差异不显著，其他均差异极显著(P<0.01)。

将经过紫外辐照40 min的果蝇饲养在3种不同质量分数的蛹虫草人工饲料上，与虽辐照40 min却饲养在基本人工饲料上相比，每种人工饲料上的子代均出现性别比降低、飞翔率升高、畸变率降低的现象。人工饲料Ⅱ上的子代性别比和畸变率分别降低0.43%、1.64 % (P<0.01)，体长和飞翔率分别增加0.12 mm 、8.2 %(P<0.05)。

由此可见，紫外辐照干扰了果蝇子代正常的生长发育；利用蛹虫草培养紫外辐照果蝇，缓解了紫外辐照对子代果蝇的辐射毒性，证明了蛹虫草的抗辐射功能。

3 讨论

关于紫外线对果蝇的辐射生物学效应，前人已经做过许多相关的研究试验，结果表明，紫外线辐照处理后果蝇的子代生长发育受到了抑制[22-23]，F1代出现畸形个体。本研究利用紫外线对果蝇分别照射20和40 min，结果表明，果蝇子代的生长发育期延长，性别比升高、体长减少、飞翔率降低、畸变率升高。这一结论和前人的研究是一致的。在本研究中，将未经紫外辐照的果蝇在不同质量分数的蛹虫草人工饲料中培养，子代的全发育期缩短、性别比降低、飞翔率升高，以人工饲料Ⅱ效果显著。该结果是对前人[24]研究的蛹虫草延寿作用的一个补充。

分别将紫外辐照20 min和40 min的果蝇在蛹虫草人工饲料中培养，一定质量分数的蛹虫草人工饲料能够缩短子代生长发育期，降低性别比、增加体长、升高飞翔率、降低畸变率。修复不同剂量的紫外辐照产生的损伤所需要的最佳蛹虫草人工饲料浓度不同，但低质量分数的蛹虫草人工饲料效果差，提高蛹虫草的质量分数才能起到抗辐射保护作用。同时研究发现，对短时间的紫外辐照，蛹虫草的保护作用明显，这说明适宜的质量分数的蛹虫草粉能够修复短时间内产生的辐照损伤，对生物体起到抗紫外保护作用。然而，长时间的紫外辐照，机体产生大量的氧化自由基，破坏了机体自身的抗氧化修复酶系统，蛹虫草的抗辐射效果减弱，如果一味地增加蛹虫草的量，不但不能修复损伤，反而会加重毒害。该结论对蛹虫草的开发和利用具有指导意义。

[1] 申进文,孙晓萍,赵旭,等.人工蛹虫草核苷类成分超声提取工艺优化及HPLC定量分析[J].河南农业大学学报,2011,45(4): 391-394.

[2] 郑壮丽,黄春花,梅彩英,等.蛹虫草国内外研究的新进展[J].环境昆虫学报,2011,33(2): 225-233.

[3] 孙艳美,尤淑霞,钟秀宏.多糖抗辐射作用的研究进展[J].中国民康医学,2014,26(11): 72-73.

[4] MATSUMURA Y,ANANTHASWAMY H N.Molecular mechanisms of photocarcinogenesis[J].Frontiers in Bioscience A Journal & Virtual Library,2002,7(1/2/3): 765-783.

[5] HERRLING T,JUNG K,FUCHS J.The role of melanin as protector against free radicals in skin and its role as free radical indicator in hair[J].Spectrochimica Acta Part A-molecular and Biomolecular Spectroscopy,2008,69(5):1429-1435.

[6] RAVI D,MUNIYAPPA H,DAS K C.Caffeine inhibits UV-mediated NF-kB activation in A2058 melanoma ce1ls:An ATMPKC-p38 MAPK-dependent mechanism[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2008,308: 193-200.

[7] RAVANAT JL,DOUKI T,CADET J.Direct and indirect effects of UV radiation on DNA and its components[J].Journal of photochemistry and photobiology，(B:Biology).2001,63(1): 88-102.

[8] CHOI J H,BESARATINIA A,LEE D H,et al.The role of DNA polymerase iota in UV mutational spectra[J].Mutation Research,2006,4(2/3): 211-220.

[9] 朱晓蕊,王卫东,王俊玲,等.紫外辐射对亚油酸的过氧化损伤研究[J].辐射研究与辐射工艺学报,2009,27(1): 57-60.

[10] 王宁,王卫东,朱晓蕊,等.紫外辐射对磷脂和脂质体的过氧化损伤及胆固醇对过氧化损伤的保护作用[J].辐射研究与辐射工艺学报,2007,25(2): 115-118.

[11] 杨明建,申海玉,郭海燕,等.紫外辐射对小白鼠血液免疫酶活性的影响[J].凯里学院学报,2011,29(6): 50-52.

[12] 陈国建,邹凡凯,石萌萌,等.紫外线A对家兔皮肤的氧化损伤研究[J].现代预防医学,2014,41(3): 419-421；428.

[13] 颜燕,杨非,姚文环,等.灰树花多糖免疫调节及抗辐射损伤作用研究[J].中国辐射卫生,2010,19(1): 6-7.

[14] LIU F,OOI V E,CHANG S T.Free radical scavenging activities of mushroom polysaccharide extracts[J].Life Sciences,1997,60(10): 763-771.

[15] PILLAI T G,NAIR C K K,JANARDHANAN K K.Polysaccharides isolated fromGanodermalucidumoccurring in southern parts of India,protects radiation induced damages bothinvitroandinvivo[J].Environmental Toxicology and Pharmacology,2008,26(1): 80-85.

[16] 申进文，史超文，许春平.肉色迷孔菌胞外多糖的结构分析与抗氧化活性研究[J].河南农业大学学报,2013,47(5): 596-599.

[17] 杨萍.银耳多糖磷酸酯化结构修饰及辐射防护作用的研究[D].北京: 北京协和医学院,2013．

[18] 向莹.滑子菇多糖结构和生物活性的研究[D].广州: 华南理工大学,2013．

[19] 叶文娇,冯武,黄文,等.蛹虫草胞外多糖的体外抗氧化活性分析[J].华中农业大学学报,2014,33(5): 105-110.

[20] 周毅峰,蔡忠雄,秦恩华,等.硒对蛹虫草茵丝代谢和总抗氧化能力的影响[J].中国酿造，2009 (4): 48-51.

[21] 陈慧婵,裴斐,杨文建,等.金针菇、香菇和蛹虫草对小鼠体内抗氧化酶活性的影响[J].食品科学,2014,35(1): 219-223.

[22] 张俊贤,郭光艳,齐志广.紫外线对果蝇生长发育和表型变异的影响[J].河北师范大学学报(自然科学版),2006,30(1):90-93.

[23] 张雅君,梁佳勇,曾慕衡.紫外线对雄果蝇寿命及子代生理的影响[J].天津农业科学,2013,19(7):75-78.

[24] 李连德,樊美珍,李增智.14种虫草多糖对果蝇成虫寿命影响的试验[J].微生物学通报,2000,27(6):427-428.

(责任编辑：朱秀英)

EffectsofCordycepsmilitarisagainstultravioletradiationondrosophilaoffspringgrowthanddevelopment

LI Jinzhe1,HUANG Yaqin1,2，YE Zhaowei1

(1.Department of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Xinyang College of Agriculture and Forestry,Xinyang 464000,China；2.Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bio-engineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China)

In order to study the antioxidant protective effects ofCordycepsmilitarisagainst ultraviolet radiation,Drosophila was radiated by different times UV and fed with different mass fractions ofCordycepsmilitarismedium.Through observing and counting its growth and development characteristics of the offspring,we found thatCordycepsmilitarispowder of 0.2% quality score can effectively reduce the whole ultraviolet irradiation Drosophila progeny development cycle (P<0.01),this medium also made UV radiation 40 min Drosophila progeny sex ratio and distortion rate lower (P<0.01),body length and fly rate increased (P<0.05).Cordycepsmilitarispowder of 0.4% quality score not only can shorten the whole development cycle (P<0.01) of UV radiation 40 minDrosophilaprogeny,but also can lower the sex ratio and distortion rate (P<0.01),and increase the body length (P<0.01)of UV radiation 20 minDrosophilaoffspring.Thus,the appropriate concentration ofCordycepsmilitarispowder was able to repair radiation damage and play an anti-UV radiation role on the body.

Cordycepsmilitaris; ultraviolet radiation;Drosophila; growth and development; development of offspring

2015-12-01

河南省科技攻关项目(152102210222)；河南省高等学校重点科研项目(16A180051)；信阳农林学院科技创新团队项目(CXTD-201606)

李尽哲(1982-)，男，河南南阳人，讲师，硕士，从事生物制药技术方面的研究。

黄雅琴(1986-)，女，河南信阳人，讲师。

1000-2340(2016)06-0767-06

Q969.4

：A