艾纳香口腔护理液抗口腔黏膜溃疡的药效学研究△

邹婧，王凯，李海艳，陈艳，武璞，庞玉新*

(1.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所 农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室，海南 儋州 571737；2.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006；3.海南省艾纳香工程技术研究中心，海南 儋州 571737)

艾纳香口腔护理液抗口腔黏膜溃疡的药效学研究△

邹婧1，2，3，王凯1，3，李海艳1，2，3，陈艳1，2，3，武璞1，3，庞玉新1，3*

(1.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所 农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室，海南 儋州 571737；2.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006；3.海南省艾纳香工程技术研究中心，海南 儋州 571737)

目的：探讨艾纳香口腔护理液在口腔黏膜溃疡药效学中的作用，为艾纳香口腔护理液的后期临床应用提供参考依据。方法：采用改良陈谦明法对SD大鼠构建口腔溃疡模型，考察艾纳香口腔护理液对大鼠组织的病理变化、溃疡愈合时间及口腔溃疡组织中的MDA、NO、NOS及SOD含量活性的影响。结果：艾纳香口腔护理液组(低、中、高)的愈合时间较溃疡组和溶剂对照组的愈合时间短，且与阳性药物组间均无明显差异；给药后的第2、4天，艾纳香口腔护理液组(低、中、高)较溃疡自然愈合组NO、NOS、MDA含量显著降低(P<0.05)；SOD含量显著升高(P<0.05)；与正常组和阳性药物组之间无统计学差异(P>0.05)。结论：艾纳香口腔护理液能有效缩短口腔溃疡愈合时间，对口腔溃疡的愈合起到了较好的促进作用。

艾纳香口腔护理液；愈合时间；NO；NOS；MDA；SOD

众所周知，口腔溃疡是最常见的口腔黏膜疾病之一，其患病率高达20%左右，居口腔黏膜病首位[1]。目前，关于口腔溃疡的发病因素有较多的不同报道，由于其病因复杂，又存在着明显的个体差异，因而推测可能是由多因素综合作用的结果导致其发生[2]。而大量的动物实验和临床实践证实，氧自由基可能是众多导致口腔溃疡因素中共同作用的枢纽环节[3-4]。

艾纳香Blumeabalsamifera(L.)DC.为菊科艾纳香属多年生木质草本植物，主要分布于我国海南、贵州、云南等省，以其全草或地上部分入药，在多个少数民族地区有着悠久的用药历史，是一种重要而实用的民间药物[5-6]。艾纳香性温味辛、苦，具有开窍醒神、镇痛活血、去痰止咳、治疗皮肤烧烫伤、晒后修复及透皮促渗透等多种功效，其主要含有挥发油和黄酮类成分，具有较好的抑菌止痒、抗氧化、镇痛等药理活性[7-9]。艾粉为艾纳香叶片水蒸气蒸馏法所得的提取物，其主要成分为左旋龙脑，并含樟脑、异龙脑、β-石竹烯和花椒油素等[10]。

本研究中的艾纳香口腔护理液是以艾纳香提取物艾粉为主要原料，将其用表面活性剂聚氧乙烯氢化蓖麻油40(RH40)及适量15%乙醇混合溶解后，与质量分数为0.2%的天然抑菌剂A.SAP、保湿剂、 甜味剂等其他添加剂按比例充分混合，再用15%乙醇定容至50 mL，静置、滤过、灌装，即得[11]。为了使艾纳香口腔护理液更好地应用于市场，保障其疗效可靠，本实验针对艾纳香口腔护理液研究了其抗口腔黏膜溃疡的药效学，为其在治疗口腔溃疡的疗效上提供保障，并为后期临床应用及市场开发提供依据。

1 材料与仪器

1.1 动物

Sprague-Dawley(SD)大鼠112只，SPF级，6周龄，体质量(180±20)g，雌雄各半；购于湖南省长沙市天勤生物技术有限公司，质量合格证号：43006700005589，许可证号：SCXK(湘)2014-0011。统一由动物实验中心单笼颗粒饲料饲养，自由饮水，室温为(22±2) ℃，湿度平均为50%～70%。

1.2 药物与试剂

艾纳香口腔护理液(实验室自制)[11]；金喉健喷雾剂(贵州宏宇药业有限公司，批号：161038)；10%水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：20121026)，多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：20140512)，10 mmol·L-1甲基紫精溶液(上海将来实业股份有限公司，批号：A003350)，一氧化氮(NO，批号：20150405)、一氧化氮合酶(NOS，批号：20150330)、丙二醛(MDA，批号：20150408)、过氧化物歧化酶(SOD，批号：20150407)测定试剂盒，均购自南京建成生物实验材料研究所。

1.3 仪器

Axio Imager M2全自动正置多功能显微镜(德国ZEISS公司)；TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；FSH-Ⅱ型电动匀浆器(江苏金坛金城国胜实验仪器厂)；ELX800酶标仪(美国BioTek公司)；UV-2102PCS型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；CPA225D型精密电子分析天平(赛多利斯仪器系统有限公司)；RM2235型手动轮转式切片机(Leica公司)。

2 方法

2.1 实验动物分组及给药

取SD大鼠133只，在1周适应性饲养及光照节律正常后随机均分为7组，即正常组、溃疡自然愈合组，15%乙醇溶剂对照组，金喉健喷雾剂阳性对照组，艾纳香口腔护理液低、中、高3个剂量组。正常组不做任何处理，余下的6组均采用改良后的陈谦明法进行口腔溃疡模型的造模[12-14]，其中溃疡自然愈合组不给药，让其自然愈合；其余各实验组大鼠造模后24 h起每日给药2次，每次0.6 mL，溶剂对照组喷15%乙醇溶液；阳性对照组喷金喉健；药物组喷艾纳香口腔护理液低(0.6 mg·mL-1，指艾粉的质量浓度，下同)、中(1.2 mg·mL-1)、高(2.4 mg·mL-1)3个浓度，每组随机取3只大鼠进行病理切片观察，再取8只进行愈合时间观察，余下8只进行相关因子的检测。

2.2 口腔溃疡动物模型的建立

本研究主要采用改良后的陈谦明法构建口腔溃疡动物模型，该方法能更好地观察动物的一般形态、溃疡面积及愈合时间[13]。经腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)，用于麻醉SD大鼠。取其仰卧位固定于手术台，用止血钳撑开上下颌，用平齿镊拉出左右两侧颊囊，再用5号皮试针将0.25 mL配制好的10 mmol·L-1甲基紫精溶液头缓慢均匀地扇形注射至两侧颊囊于黏膜下层约0.8 cm处，并用预制直径为5 mm、温度为100 ℃铁钉在注射处触烫3 s。手电观察即可见该处有约5 mm的白色损害；24 h肉眼观察颊囊处有直径约为5 mm的溃疡形成，表面有黄色假膜覆盖，周围组织充血水肿，并有炎性分泌物渗出，大鼠口腔内唾液分泌量增加。

2.3 溃疡组织病理变化的观察

各组随机取3只SD大鼠，正常组不做处理，溃疡自然愈合组在造模后24 h取样，观察组织形成溃疡的形态；其余各实验组大鼠造模后24 h起每日给药2次，每次0.6 mL，溶剂对照组喷15%乙醇溶液；阳性对照组喷金喉健；药物组喷艾纳香口腔护理液低、中、高3个浓度，在肉眼观察愈合后处死，各组在颊囊黏膜溃疡处切取5 mm×3 mm达黏膜下层约1 mm厚的组织，用无菌0.9%氯化钠溶液冲洗后置于4%多聚甲醛中固定，24 h后取出标本进行石蜡包埋，并采用HE染色制作病理组织切片并在光镜下观察分析。

2.4 溃疡愈合时间观察

从余下各组中再随机抽取8只SD大鼠，进行愈合时间观察。在肉眼观察溃疡愈合后处死，并在颊部黏膜溃疡处切取5 mm×3 mm达黏膜下层约1 mm厚的组织，用无菌0.9%氯化钠溶液反复冲洗后置于4%多聚甲醛中固定，24 h后取出标本进行石蜡包埋，并对照各组HE染色病理组织切片图分析，进一步判断其是否愈合，若病理学显示上皮细胞基本恢复完整、无炎性细胞浸润、形态与正常组相似即为愈合，否则记为未愈合。

2.5 溃疡组织中NO、NOS、MDA及SOD的含量测定

每组剩余的8只实验动物，重复2.2造模的方法，分别在给药第2、4天的相同时间点进行取样，每次随机抽取4只，在颊囊黏膜溃疡处切取5 mm×3 mm达黏膜下层约1 mm 厚的组织，用4 ℃的无菌0.9%氯化钠溶液漂洗，除去血液，用滤纸拭干后称重后将组织剪碎，置于匀浆器中并加入9倍组织质量的0.9%氯化钠溶液，研磨成10%的组织匀浆，随后将匀浆液倒入离心管中，以3000 r·min-1的速度离心10 min，吸取上清液备用。按试剂盒说明书操作步骤测定各组样品的吸光度值后，再按试剂盒说明书中的公式计算组织中NO、NOS、MDA及SOD的含量。

3 结果

3.1 溃疡组织观察

如图1所示，建模前大鼠的活动正常，体重日益增加，反应灵活，颊囊处黏膜光滑红润(见图1A)；采用改良陈谦明法建模后，大鼠摄食量及饮水量减少，活动量减少，体重减轻，唇边出现流口水现象，且大便稀疏。对大鼠颊囊形成的溃疡面进行观察，发现有凹凸不平的椭圆形黄白色假膜覆盖，组织充血红肿，直径约为5～6 mm(见图1B)；肉眼观察到的愈合组溃疡面基本愈合，无红肿糜烂现象，与正常组织形态相似(见图1C)；在显微镜下观察到，正常组织上皮细胞结构完整，成纤维细胞完整，细胞核明显(见图1D)；溃疡组织可见上皮细胞脱落溶解，有大量的炎性细胞浸润，表面覆盖坏死组织(见图1E)；愈合组的上皮细胞结构逐渐恢复完整，炎性细胞数量减少，与正常组的显微形态相似。

图1 各组别动物黏膜组织及病理学切片图(HE，×200)

3.2 愈合时间的统计

注：与溃疡自然愈合组比较，*P<0.05；与15%乙醇溶剂对照组比较，#P<0.05。图2 各组大鼠溃疡平均愈合时间(n=8)

根据分组情况，各大鼠口腔黏膜溃疡的愈合时间统计见图2。溃疡自然愈合组在第8天的时候开始出现愈合，第11天的时候痊愈，平均愈合天数为9.63 d；15%乙醇溶剂对照组同样在第8天的时候开始出现愈合，第11天的时候痊愈，平均愈合天数为9.25 d；金喉健喷雾剂阳性对照组在第4天的时候开始出现愈合，第7天的时候痊愈，平均愈合天数为5.50 d；艾纳香口腔护理液低、中、高3个剂量组在观察后的第4天开始出现愈合，第7天时痊愈，平均愈合天数分别为5.88、5.25、5.00 d。金喉健阳性对照组及艾纳香口腔护理液低、中、高组的溃疡平均愈合时间均比溃疡自然愈合组和15%乙醇溶剂对照组短(P<0.05)；艾纳香口腔护理液低、中、高组之间的愈合时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

3.3 第2、4天取样的各组样品组织中NO、NOS、MDA及SOD的含量比较

按照试剂盒说明对第2天不同组别样品组织中的NO、NOS、MDA及SOD的含量进行检测，结果发现各给药组与溃疡自然愈合组比较，组织中的NO、NOS及MDA含量活性显著降低(P<0.05)，其中高浓度组的NOS含量降低明显(P<0.01)，阳性对照组及艾纳香口腔护理液低、中、高组的MDA含量降低明显(P<0.01，P<0.001)；同时发现阳性对照组及艾纳香口腔护理液低、中、高组与溃疡自然愈合组比较，组织中的SOD的含量显著升高(P<0.05)。与正常对照组比较，阳性对照组及艾纳香口腔护理液低、中、高浓度组织中的NO、NOS、MDA及SOD含量则无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 第2天各组样品组织中NO、NOS、MDA及SOD的含量比较 /μmol·g-1

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与溃疡自然愈合组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；下同。

按照试剂盒说明对第4天不同组别样品组织中的NO、NOS、MDA及SOD的含量进行检测，结果发现阳性对照组及艾纳香口腔护理液低、中、高组与溃疡自然愈合组比较，组织中的NO、NOS及MDA含量活性显著降低(P<0.05)，其中艾纳香口腔护理液低、中、高浓度组的NO含量降低明显(P<0.01)，阳性对照组及艾纳香口腔护理液中、高组的NOS含量降低明显(P<0.01)；同时发现阳性对照组及艾纳香口腔护理液低、中、高浓度组的SOD含量显著升高(P<0.05)，其中艾纳香口腔护理液高浓度组的SOD含量升高明显(P<0.01)。与正常对照组比较，阳性对照组及艾纳香口腔护理液低、中、高浓度组织中的NO、NOS、MDA及SOD含量则无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 第4天各组样品组织中NO、NOS、MDA及SOD的含量比较 /μmol·g-1

4 讨论

本文中的艾纳香口腔护理液是以艾纳香提取物为主要原料药，辅以乙醇、甘油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、A.SAP、木糖醇、食用香精等相应辅料组成[11]，为客观地评价其疗效，本文通过对该护理液的口腔溃疡药效学动物实验进行研究，观察组织病理切片的形态及不同的给药浓度下对溃疡的愈合时间进行统计。实验结果表明，艾纳香口护理液处理后的组别在第4天开始出现愈合，所需时间短于溃疡自然愈合组和15%乙醇溶剂对照组(P<0.05)，其中以艾纳香口腔护理液高浓度组(2.4 mg·mL-1)的愈合时间最短；艾纳香口腔护理液低、中、高组之间的愈合时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明艾纳香口腔护理液在治疗口腔溃疡上有一定的疗效。

此外，本文分别对造模给药后的第2、4天各组织中的NO、NOS、MDA及SOD的含量变化进行了检测。NO具有传递和调节介质的作用，是细胞信息传递过程中重要的调节因子，它能与氧自由基作用，在机体的炎症反应过程中引起组织细胞的损伤和增值，延迟溃疡愈合；NOS在NO的合成过程中至关重要，在溃疡急性期，组织中的NO和NOS与正常组比较均有所增高，随着溃疡逐渐愈合，NO和NOS的含量均减少，呈现出下降的趋势，说明在溃疡愈合的过程中炎症反应逐渐减轻，在一定程度上反映了溃疡愈合的效果显著；研究发现复发性口腔溃疡患者的SOD比正常人要低，而脂质过氧化物含量显著升高，说明SOD的活性反映了机体清除氧自由基的能力，揭示在复发性口腔溃疡的发病机制中大量产生的氧自由基以及SOD活性下降可能是引起组织破坏的重要环节；而MDA是脂质过氧化反应的最终产物，会导致体内SOD活性进一步降低，从而使溃疡更加严重。因此测定SOD和MDA的含量变化，可以间接地反映出氧自由基在体内的生成和清除情况，以及对组织损伤程度在体内抗氧化防御作用的功能状况[12]。本实验结果表明，实验大鼠造模成功后，NO、NOS及MDA的含量明显升高，SOD活性明显下降；在给药后第2、4天，艾纳香口腔护理液低、中、高组的NO、NOS及MDA的含量显著降低(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.05)。而艾纳香口腔护理液组与金喉健阳性药物组间无明显差异，说明该艾纳香口腔护理液在治疗口腔溃疡的作用上与阳性药物组疗效相似。

综上所述，艾纳香口腔护理液能有效缩短口腔溃疡的愈合时间，对组织中的NO、NOS、SOD及MDA的含量有一定影响，在口腔溃疡的治疗上具有一定的促进作用，在0.6～2.4 mg·mL-1的浓度范围内对治疗口腔溃疡上有一定的疗效。本实验为艾纳香口腔护理液在治疗口腔溃疡疗效方面的研究提供了参考，并为后期临床应用及市场开发提供依据。

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StudyonOralMucosaUlcerPharmacodynamicsofBlumeaMouthwash

ZOU Jing1，2，3，WANGKai1，3，LIHaiyan1，2，3，CHENYan1，2，3，WUPu1，3，PANGYuxin1，3*

(1.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina，Danzhou571737，China；2.SchoolofTraditionalChineseMedicine，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China；3.HainanProvincialEngineeringResearchCenterforBlumeaBalsamifera，Danzhou571737，China)

Objective：To provide reference for the later clinical application of Blumea mouthwash，the effect of Blumea mouthwash in the oral mucosa ulcer pharmacodynamics was investigated.Methods：Oral ulcer model of SD rats was constructed by using the modified method of the Chen Qian Ming.The histopathological changes，the ulcer healing time and the influence about the content and activation activity of malondialdehyde(MDA)，nitric oxide(NO)，nitric oxide synthase(NOS)and superoxide dismutase(SOD)in oral ulcer tissues of Blumea mouthwash were evaluated.Results：The healing time of Blumea mouthwash(low，medium，high)group wasshorter than that of the control group，while there wasno significant difference between the mouthwash group and the positive drug group.After administration of the first 2，4 days，the content of NO、NOS、MDA of Blumea mouthwash(low，medium，high)group significantly decreased relative to the ulcer group(P<0.05).The content of SOD significantly increased(P<0.05).And compared with normal and positive drug group，there is no statistical significance(P> 0.05).Conclusion：The experimental results suggest that Blumea mouthwash could shorten the ulcer healing time effectively，and is beneficial for the healing of ulcer.

Blumea mouthwash；healing time；NO；NOS；MDA；SOD

2016-02-23)

国家自然科学基金(81374065)；贵州省黔科合重大专项(2013-6011)

*

庞玉新，博士，副研究员，研究方向：南药资源研究与开发，Tel：(0898)23300268，E-mail：blumeachina@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.012