HPLC-PAD法同时测定复方黄柏液涂剂中9种成分的含量

王玉团，许丽丽，徐丽华

(山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)

HPLC-PAD法同时测定复方黄柏液涂剂中9种成分的含量

王玉团*，许丽丽，徐丽华

(山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)

目的：建立同时测定复方黄柏液涂剂中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸C、盐酸小檗碱和连翘苷含量的方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.5%磷酸为流动相(梯度洗脱)，流速为1.0 mL·min-1；柱温为25 ℃；PAD检测器。结果：9种成分含量测定的线性关系良好，线性范围和相关系数分别为12.37～185.55(r=0.999 9)、38.80～582.06(r=1.000 0)、15.90～238.50(r=0.999 9)、1.52～22.86(r=0.999 8)、48.26～723.87(r=1.000 0)、5.90～88.56(r=0.999 3)、6.58～98.64(r=1.000 0)、9.79～119.58(r=0.999 9)、16.91～253.71 μg·mL-1(r=0.999 9)；平均加样回收率分别为98.63%、102.57%、101.31%、97.95%、102.59%、98.41%、97.59%、98.77%、101.31%；方法的精密度良好，RSD均小于2.0%(n=6)。结论：该方法准确，可靠，可用于复方黄柏液涂剂的质量控制。

高效液相色谱法-二级管阵列检测器；复方黄柏液涂剂；含量测定

复方黄柏液涂剂主要由黄柏、连翘、金银花、蒲公英和地龙五味药组成。主要作用是清热解毒、消肿祛腐。用于疮疡溃后伤口感染，属阳证者。是临床应用较广泛的治疗皮肤溃疡等疾病的外用制剂。现行标准收载于2015年版《中华人民共和国药典》一部，仅收载盐酸小檗碱和连翘苷两种成分的含量测定[1]。经研究发现，制剂中还含有新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸C等成分，以上成分均具有较强的抗菌药理作用，特别是所含绿原酸类成分普遍认为具有很好的抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、军团菌等细菌的作用，其抗菌机制可能与非竞争性抑制细菌体内的芳基胺乙酰转移酶有关[2-5]。研究还发现，连翘苷抑菌作用并不是很强，而连翘酯苷则有明显的抗炎、解热、抗内毒素、抗菌和抗病毒等作用，故有必要对制剂中连翘酯苷A进行质量控制[6-8]。本文对复方黄柏液涂剂中9种成分进行含量测定，旨在为复方黄柏液涂剂的质量评价提供参考，有利于进一步提高复方黄柏液涂剂的质量控制水平。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪；Waters 2448 PAD检测器；METTLER AE240电子天平；超声波清洗仪(苏州富怡达公司)。

1.2 试药

连翘苷(中国食品药品检定研究院，批号：110821-201514，含量以93.5%计)；盐酸小檗碱(中国食品药品检定研究院，批号：110713-201212，含量以86.7%计)；绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110753-200413)；连翘酯苷A(中国食品药品检定研究院，批号：111810-201001，含量以94.3%计)；新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸C(成都普思生物科技有限公司，含量≥98%，批号分别为ps010603-05，ps010512-05，ps08103102，ps08110401)；盐酸黄柏碱(四川维克奇生物科技公司，批号20100410，含量>98%)；复方黄柏液涂剂(山东汉方制药有限公司)；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

参考相关文献[9-11]，采用如下色谱条件，色谱柱：Agilent extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脱，0～15 min，5%～25%A，15～70 min，25%～35%A，70～80 min，35%～45%A；流速：1 mL·min-1；柱温：25 ℃；PAD检测器(波长范围190～450 nm)。在此色谱条件下各色谱峰峰形较好，与相邻峰的分离度均大于1.5，符合含量测定要求，理论板数以新绿原酸峰计为6878。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸C、盐酸小檗碱测定波长为325 nm，连翘苷测定波长为228 nm，分别进样量10 μL，色谱图见图1。

注：A.混和对照品(325 nm)；B.混和对照品(228 nm)；C.供试品(325 nm)；D.供试品(228 nm)；1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.盐酸黄柏碱；5.连翘酯苷A；6.异绿原酸B；7.异绿原酸C；8.盐酸小檗碱；9.连翘苷。图1 复方黄柏液涂剂HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

配制一定浓度的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸C、盐酸小檗碱和连翘苷对照品甲醇储备液，精密量取对照储备液各1 mL，置50 mL棕色量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，制成质量浓度分别为61.85、194.02、79.05、7.62、241.29、29.52、32.88、39.86、84.57 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品5 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇4 mL，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)5 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.4 线性关系的考察

分别精密吸取混合对照品溶液2、5、10、15、20、30 μL，注入高效液相色谱仪测定。以对照品浓度X(μg·mL-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，结果见表1。

表1 9种成分的回归方程，相关系数和线性范围

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，按照2.1项下色谱条件，重复进样6次，记录峰面积，9种成分峰面积的RSD分别为1.2%、0.8%、0.2%、0.7%、0.6%、0.2%、1.1%、0.8%、1.0%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液10 μL，按照2.1项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积，9种成分峰面积的RSD在0.2%～1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密量取复方黄柏液涂剂6份，每份5 mL，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，进行测定。结果9种成分含量的RSD在0.2%～2.1%，表明样品的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的复方黄柏液涂剂样品6份(样2，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸C、盐酸小檗碱和连翘苷9种成分质量浓度分别为123、388、158、15.2、482、58.5、65.2、79.5、169 μg·mL-1)，每份2.5 mL，各精密加入混合对照品溶液5 mL，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)5 min，按照2.3项下方法制备供试品溶液，进样10 μL，进行测定，计算平均回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

表2(续)

2.9 样品的含量测定

按2.3项下方法制备供试品溶液，并按照2.1项下色谱条件进行测定。9种成分的平均含量见表3。

表3 9种成分的含量测定结果 /μg·mL-1

3 讨论

3.1 检测波长的选择

新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B和异绿原酸C在324～327 nm内有最大吸收，连翘酯苷A在328 nm附近有最大吸收，盐酸小檗碱在264 nm附近有最大吸收，盐酸黄柏碱在284 nm附近有最大吸收，以上8种成分均在325 nm处具有很强的吸收，与杂质能够完全分离，为简化实验过程，故以上8种成分含量测定波长选择为325 nm。连翘苷在波长325 nm处无吸收，其最大吸收波长为228 nm，与杂质能够完全分离，故选择228 nm作为连翘苷的含量测定波长。同时测定以上9种成分，仅需要提取两个波长下的色谱图就可以实现，且基线更加稳定，优于不同时间切换不同测定波长方法。

3.2 化学成分探索

在本实验色谱条件下，在盐酸黄柏碱和连翘酯苷A色谱峰之间，存在两个较大的色谱峰，经进一步探索，主要来自处方中连翘，具体成分未知。将进一步进行相关实验研究，以更好地探索复方黄柏液涂剂所含其他化学成分。

本实验通过测定复方黄柏液涂剂中9种成分的含量，明确了制剂中有效成分并计算出其准确含量，为临床准确、安全、合理用药提供了参考，也有利于进一步提高药品质量控制水平。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 姚俊，赵霞.复方黄柏液最新临床应用进展[J].中国新药杂志，2014，23(3)：308-312.

[3] 李友山，杨博华.复方黄柏液外治糖尿病足溃疡对炎性因子及生长因子的影响[J].中国新药杂志，2014，23(10)：1163-1166.

[4] 潘军.RP-HPLC法同时测定复方黄柏液中盐酸小檗碱，绿原酸和连翘苷的含量[J].齐鲁药事，2009，28(9)：524-526.

[5] 程力惠，卢丽霞.复方黄柏液的质量标准研究[J].亚热带植物科学，2012，41(2)：13-18

[6] 范毅，陈玲，朱杰，等.连翘叶化学成分[J].中国实验方剂学杂志，2015，21(24)：22-25.

[7] 邰晓鹏，臧恒昌.HPLC法测定乳痛安口服液中连翘苷的含量[J].药学研究，2015，24(12)：703-705.

[8] 邢丽红，李文龙，瞿海斌.金银花提取物中5种有机酸含量测定的紫外光谱法[J].药物分析杂志，2011，31(3)：547-551.

[9] 陈芳，邓雁如，郭利平.HPLC法同时测定金银花及金芪降糖片中9种成分的含量[J].天津中医药，2014，31(3)：168-172.

[10] 陈天朝，翟来超.HPLC梯度洗脱测定黄柏中盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱的含量[J].中医研究，2011，24(4)：23-25.

[11] 王玉团，许丽丽，林晓，等.RP-HPLC法同时测定羚羊感冒胶囊中5种成分的含量[J].中国药房，2014，25(47)：4475-4477.

SimultaneousDeterminationofNineEffectiveComponentsinFufangHuangbaiyeTujibyHPLC-PAD

WANG Yutuan*，XuLili，XuLihua

(ShandongInstituteForFoodAndDrugControl，250101，China)

Objective：To establish a method for simultaneous determination of neochlorogenic acid，chlorogenic acid，4-dicaffeoylquinic acid，phellodendrine chloride，forsythoside A，isochlorogenic acid B，isochlorogenicacidc，berberinehydrochlorideand phillyrin in Fufang Huangbaiye Tuji.Methods：HPLC method was adopted，Agilent extend C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)column was used with acetonitrile-0.5% phosphoric acid solution as the mobile phase for gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1，the column temperature was 25 ℃ and the PAD detection was used.Results：A good linearity of the above compounds was obtained with the correlation coefficients ranged from 12.37～185.55(r=0.999 9)，38.80～582.06(r=1.000 0)，15.90～238.50(r=0.999 9)，1.52～22.86(r=0.999 8)，48.26～723.87(r=1.000 0)，5.90～88.56(r=0.999 3)，6.58～98.64 μg/mL(r=1.000 0)，9.79～119.58(r=0.999 9)and 16.91～253.71 μg·mL-1(r=0.999 9)，respectively.The average recoveries were 198.63%，102.57%，101.31%，97.95%，102.59%，98.41%，97.59%，98.77% and 101.31%，respectively.The precisions of the method were good，and the RSDs were less than 2.0%(n=5).Conclusion：The method was accurate and reliable，that it could be used for control the quality of Fufang Huangbaiye Tuji.

HPLC-PAD；Fufang Huangbaiye Tuji；content determination

2016-02-18)

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王玉团，主管药师，研究方向：中药质量控制与研究；Tel：(0531)81216522，E-mail：wytuan@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.026