基于全基因组的紫芝细胞色素P450分析△

曾欣宜，朱英杰，李滢，孙超*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700)

·基础研究·

基于全基因组的紫芝细胞色素P450分析△

曾欣宜1，朱英杰2，李滢1，孙超1*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700)

目的：紫芝是多孔菌科灵芝属的重要传统中药。细胞色素P450是一类含血红素的单加氧酶。本研究的目的是对紫芝基因组编码的CYP450序列进行比对及系统进化分析。方法：发掘紫芝基因组编码的所有P450基因，构建紫芝CYP450系统进化树，比较灵芝属3个已测序物种中P450基因家族的差异，并对紫芝中可能参与三萜生物合成的P450基因家族进行染色体定位和内含子相位分析。结果：紫芝基因组共编码228个CYP450基因，其中包括9个假基因，在进化上分为3个分支，分布在41个家族中，其中CYP5359家族最大，包含有53条序列。紫芝所有的P450基因家族在其他两个灵芝属真菌中都存在。CYP512和CYP5144家族可能参与灵芝酸生物合成，其中一些家族成员可能是通过基因复制进化而来的。结论：紫芝P450基因家族的系统进化分析与进化机制研究为进一步揭示紫芝P450基因的功能与生理生化作用奠定了基础。

紫芝；CYP450；灵芝三萜；进化

紫芝Ganodermasinense是名贵传统中药材，为担子菌纲(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属Ganodermae真菌[1]。现代药理学研究表明紫芝具有提高免疫力，抗肿瘤[2-3]，调节血糖血脂[4-7]，延缓衰老[8]等多种功效。紫芝与赤芝G.lucidum作为中药灵芝的基原物种，已被收录于《中华人民共和国药典》2010版[9]。

本课题组相继完成了赤芝和紫芝基因组精细图，为研究灵芝有效成分的生物合成及其他生物学问题奠定了基础[10-11]。灵芝三萜是灵芝的主要活性成分之一，目前已从灵芝中分离得到150多种[12]。灵芝三萜是高度氧化的羊毛甾醇衍生物，推测有多个细胞色素P450单加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases，P450s)参与了灵芝三萜的生物合成过程。P450s是一类能够在温和的条件下把底物中反应惰性的碳氢键氧化的单加氧酶，是参与次生代谢的重要酶类之一，根据标准的细胞色素P450命名法，目前已鉴定大约19 000种P450s[13]。P450s主要参与的反应有：羟基化、环氧化、脱烷基化、碘化硫化、脱氨基化、脱硫化、脱卤化和硝基还原作用[14]。本研究对紫芝编码的所有P450基因进行了分类和进化分析，然后与灵芝属其它两个已测序真菌赤芝和Ganodermasp.中的P450基因进行了比较研究，并对可能参与灵芝酸合成的P450家族进行了预测。

1 材料与方法

1.1 序列来源

赤芝和紫芝细胞色素P450数据来源于本课题组紫芝基因组。

1.2 分析软件及处理方法

1.2.1 系统进化分析 本文中用到的系统进化分析软件有：分子进化遗传分析软件MEGA6.06，用邻接法(Neighbor Joining，NJ)构建系统发育树，自举检验法Bootstrap(1000次)检验各分支的支持率[15]。

1.2.2 内含子相位分析 CYP512基因和CYP5144基因的内含子相位图是利用in-house脚本对基因结构注释文件进行分析得来。

2 结果与分析

2.1 紫芝CYP450分析

紫芝P450有228条序列，9条假P450序列，分布在41个家族中，其中CYP5359家族最为庞大，有53条序列均归属到该家族，其次为39条序列的CYP5150家族和31条序列的CYP512家族(图1)。其中最长的3条CYP450蛋白序列分别是：CYP6005B1(1102aa)、CYP6005A1(1024aa)和CYP63A37(614aa)，而最短的条序列仅200多氨基酸：CYP5136D12P(221aa)和CYP5349A3(218aa)。对紫芝CYP450的系统进化分析，发现可以分成3枝(图2)，其中最大的一枝共有132个CYP家族，包括：CYP5150(39)、CYP512(31)、CYP5035(25)、CYP5136(9)、CYP63(7)、CYP537(2)、CYP5140(2)、CYP5364(2)以及仅1条序列的CYP5151、CYP5138、CYP5137、CYP51、CYP5341、CYP5340和CYP5141。拥有88个CYP家族是第二大枝，这枝有着紫芝CYP家族中数目最多的CYP5359家族，共53条序列，其他家族数目均较少，为6条序列的CYP5037，以及4条序列的CYP5144家族和CYP5148家族，两外还有3条序列的CYP5348家族和2条序列的CYP5058家族，以及仅1条序列的CYP502、CYP5351、CYP5158、CYP5065、CYP5360、CYP5152、CYP5349 、CYP5361、CYP5362、CYP5365、CYP53、CYP61、CYP642、CYP5347、CYP5366和CYP5139。第三枝所含CYP家族最少，共4个家族，包括7条序列：CYP505(3)、CYP6005(2)、CYP5141(1)和CYP5156(1)。在这枝中，CYP6005B1和CYP6005A1有着紫芝CYP450中最长的序列。

2.2 灵芝属真菌P450分类及家族比较

对基因组水平的灵芝属真菌P4 50分析发现(图1)，灵芝属的三个真菌的P450数目庞大，家族类别较多，虽比植物少，但是在真菌中，是较为丰富的。在这三种灵芝属真菌中，相较于其他家族，CYP63、CYP512、CYP5035、CYP5037、CYP5136、CYP5139、CYP5144、CYP5150和CYP5359的数目是较多的，而CYP53、CYP61、CYP502、CYP642、CYP5065、CYP5137、CYP5138、CYP5151、CYP5152、CYP5156、CYP5158、CYP5347、CYP5349、CYP5351、CYP5360、CYP5362、CYP5365和CYP5366这些CYP家族在三种灵芝属真菌中的数目均为一。其中紫芝CYP450家族最为庞大，并且紫芝CYP512、CYP5035、CYP5150和CYP5359均明显多于其他两个灵芝属真菌(图2)。而在G.sp中，CYP63、CYP5136、CYP5144和CYP5148是较多的。在赤芝中，仅CYP5356是其独有的P450家族，而其他家族与另外两种灵芝属在数量上均较为一致，且并不多于其他两种。

2.3 可能参与紫芝酸生物合成的CYP450分析

研究表明，CYP512和CYP5144在动物中对甾体激素、睾酮等激素的结构进行修饰，而在赤芝中CYP512基因与CYP5144基因与羊毛甾醇合酶(LSS)共表达[11]，因此预测这两个P450家族可能参与紫芝三萜的生物合成。

图1 紫芝CYP450家族系统进化树

图2 灵芝属真菌P450家族分类比较(图中G.sp数据来源于Khajamohiddin[16])

搜索CYP512和CYP5144基因后，对其染色体位置图(图3A)进行分析发现，这两个家族的基因分布在2号、3号、4号、5号、7号、10号、11号和12号染色体，而1号染色体、6号染色体、8号染色体和9号染色体上均没有分布。在5号染色体的0-500kb的位置共分布18个基因(图3B)，并且分布位置是临近的，因此推测可能存在重复基因的现象，对此构建了N-J树和内含子相位图(图3C)。分析后可以发现，GS09913和GS09914可能互为重复基因，从内含子相位图来看，极有可能为某段外显子的“移动”所导致的基因重复，在N-J树中这两个基因进化关系也十分接近。GS06038和GS06037在2号染色体上位置接近，内含子相位也一致，由此可推测这两个基因可能为重复基因。同样地，GS04141和GS04140、GS07489和GS07486、GS03132和GS03141以及GS11489和GS11434也可能是互为重复基因。

图3 CYP512基因和CYP5144基因分析

3 讨论

紫芝CYP450共有228条P450序列，9条假P450s，分布在41个家族中，CYP5359家族(53 P450s)数目最多，其次为CYP5150家族(39 P450s)和CYP512家族(31 P450s)。对紫芝CYP450的系统进化可分为三枝，其中132个P450聚在数目最多的一枝，88个P450聚成的是第二枝，其中包括紫芝中数目最多的CYP5359家族，第三枝的数目较少，仅7个P450，聚在该枝的是紫芝中P450序列最长的几条。而对三种灵芝属真菌P450比较分析发现，在真菌中，其P450数目是比较庞大的，且CYP63、CYP512、CYP5035、CYP5037、CYP5136、CYP5139、CYP5144、CYP5150和CYP5359这些P450家族在三种灵芝中的数目都是较多的。值得关注的是，在三种灵芝属CYP家族分析中，每种灵芝的基因组对P450家族数目的偏好是不同的。在紫芝中，CYP512、CYP5035、CYP5150和CYP5359这四个家族是其所偏好的，家族数目明显多于其他两种灵芝。而在G.sp中，CYP63、CYP5136、CYP5144和CYP5148是其偏好的。与另外两种灵芝相比，赤芝并没有其特有偏好的P450家族。

据报道，P450基因常与参与次生代谢的基因组成基因簇，共同调控灵芝次生代谢。在紫芝中，同样地，预测CYP512家族和CYP5144家族极有可能与LSS(羊毛甾醇合酶)共表达，参与到紫芝三萜的生物合成中。进而对这两个家族的基因进行分析，基因分布在染色体的位置图表明其中有18个基因分布在5号染色体上，且位于100～600 Kb的位置。进一部分析基因的内含子相位和系统进化分析后发现，可能存在多组基因重复现象，分别为GS09913和GS09914、GS06038和GS06037、GS04141和GS04140、GS07489和GS07486、GS03132和GS03141以及GS11489和GS11434。

灵芝三萜是灵芝中主要的活性成分，它们是由共同的底物环状骨架羊毛甾醇生成的，而CYP450是这一类底物的重要修饰酶家族。因此，通过对紫芝中CYP450的组成、分类及灵芝属内的比较分析，对CYP450的功能验证及解析紫芝中三萜类成分的生物合成奠定了基础。为中药灵芝资源的保护及合理开发利用，以及道地药材的挖掘提供理论指导。

[1] 林志彬.灵芝的现代研究[M].北京：北京大学医学出版社，2007.25-198.

[2] Liu J Q，Wang C F，Li Y，et al.Isolation and bioactivity evaluation of terpenoids from the medicinal fungusGanodermasinense[J].PlantaMed，2012，78(4)：368-376.

[3] Yue G G，Fung K P，Tse G M，et al.Comparative studies of various ganoderma species and their different parts with regard to their antitumor and immunomodulating activities in vitro[J].JAlternComplement，2006，12(8)：777-789.

[4] Sato N，Ma C M，Komatsu K，et al.Triterpene-Farnesyl hydroquinone conjugates fromGanodermasinense[J].Nat Prod，2009，72(5)：958-961.

[5] Yue G G，Chan B C，Han X Q，et al.Immunomodulatory Activities ofGanodermasinensePolysaccharides in Human Immune Cells[J].NutrCancer，2013，65(5)：765-774.

[6] Han X Q，Chan B C，Dong C，et al.Isolation,structure characterization，and immunomodulating activity of a hyperbranched polysaccharide from the fruiting bodies ofGanodermasinense[J].JAgricFoodChem，2012，60(17)：4276-4281.

[7] Wu H T，Lu F H，Su Y C，et al.Invivoandinvitroanti-tumor effects of fungal extracts[J].Molecules，2014，19(2)：2546-2556.

[8] Paterson R R M.Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory[J].Phytochemistry，2006，67(18)：1985-2001

[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：205.

[10] Chen S L，Xu J，Liu C，et al.Genome sequence of the model medicinal mushroomGanodermalucidum[J].Nat.Commun.，2012(3)：913.

[11] Zhu Y J，Xu J，Sun C，et al.Chromosome-level genome maP provides insights into diverse defense mechanisms in the medicinal fungusGanodermasinense[J].Sci.Rep.，2015(5)：11087.

[12] 李晔，朱忠敏，姚渭溪，等.灵芝三萜类化合物的研究进展[J].中国中药杂志，2012，37(2)：165-171.

[13] Nelson D R.Progress in tracing the evolutionary paths of cytochrome P450[J].ActaBiochim.Biophys.Sin.，2011，1814(1)：14-18.

[14] Sono M，Roach M P，Coulter E D，et al.Hemecontaining oxygenases[J].Chem.Rev.，1996，96(7)：2841-2888.

[15] Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al.MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0.[J]Mol.Biol.Evol.，2013，30(12)：2725-2729.

[16] Khajamohiddin S，David R.，Robert R，et al.Genomewide annotation and comparative genomics of cytochrome P450 monooxygebases (P450s) in the polypore speciesBjerkanderaadusta，Gandermasp.andPhlebiabrevispora[J].Mycologia，2013，105(6)：1445-1455.

ResearchofCytochromeP450inGanodermasinenseBasedonAnalysisofGenomicData

ZENG Xinyi1，ZHUYingjie2，LIYing1，SUNChao1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChinaAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：Ganodermasinense，belonging to the Polyporales，Ganodermae，is one of the most well-known medicinal mushrooms in the world.Cytochrome P450s are monooxygenases containing heme.Our study aims to understand the evolution of P450 families inG.sinense.Methods：We found all P450 genes from theG.sinensegenome and constructed their phylogenetic tree.The P450s fromG.sinensewere compared with those from the other two sequenced fungi from Ganoderma genus.We also analyzed the chromosome location and intron phases of the P450 genes possibly involved in the biosynthesis of triterpenoids.Results：TheG.sinensegenome encoded a total of 228 P450 genes，including 9 pseudogenes.All of them were divided into three clans and 41 families，among which，CYP5359 is the biggest family containing 53 members.All the P450 families inG.sinensealso exist in the other two sequenced Ganoderma species.CYP512 and CYP5144 families were supposed to be involved in the biosynthesis of triterpenoids and some of their members were generated by gene duplications.Conclusion：We analyzed the phylogenetics of P450s inG.sinenseand explored their possible evolutional mechanism，which will lay the foundation for further study on the function and physiological activities of these P450s.

Ganodermasinense；CYP450；triterpenoid；evolution

2016-04-06)

国家自然科学基金委面上项目(81273485)；国家自然科学基金委面上项目(81573704)

*

孙超，研究员，研究方向：功能基因组学；Tel：(010) 57833197，E-mail：csun@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.005