银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激反应的影响*

白志超陈名超李鹤飞（.河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 05600；.河北工程大学附属医院，河北 邯郸05600）

银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激反应的影响*

白志超1△陈名超2李鹤飞1
（1.河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001；2.河北工程大学附属医院，河北 邯郸056002）

目的 观察银杏内酯B（GB）对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激反应的影响并探讨其机制。方法将120只大鼠按照随机数字表法分为假手术组，模型组，GB高、中、低剂量组和地尔硫组，每组20只；采用夹闭冠状动脉的方法制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型。TTC染色法计算心肌梗死面积，生化分析法检测心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量，血清中谷草转氨酶（AST）、磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脱氢酶（LDH）活性，HE染色法观察心肌组织形态结构改变，TUNEL法观察心肌细胞凋亡状况并计算凋亡指数 （AI）；Western blot法检测心肌组织中NF-κB蛋白表达并进行半定量分析。结果 与模型组比较，GB高中低剂量组大鼠心肌组织梗死面积显著降低，SOD、GSH-Px、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低，血清中AST、CPK、LDH活性显著降低 （P＜0.05或P＜0.01）；GB各组心肌组织病变和心肌细胞凋亡状况较模型组均呈不同程度改善，其中30、60 mg/kg组AI显著降低，NF-κB蛋白表达显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。结论 GB具有抑制心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激反应的作用，这一作用可能与其能够降低心肌缺血再灌注后心肌损伤有关。

银杏内酯B 心肌 缺血再灌注 氧化应激 影响

【Abstract】Objective：To investigate the effects and mechanism of Ginkgolide B（GB）on oxidative stress in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods：120 rats were randomly divided into six groups：the sham group，the model group，GB high/middle/low groups and diltiazem group，20 in each.The models with myocardial ischemia-reperfusion injury were made by clamping the artery.The areas of myocardial infarction was analyzed by TTC staining；the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in myocardial tissue were determined，as well as the activity of AST，CPK，LDH in serum；the histopathological changes of myocardial tissue was observed by HE staining；the apoptosis of cardiomyocytes was observed by TUNEL and the apoptosis index（AI）was calculated；the expression of NF-κB was examined by Western blotting and semi-quantitative analysis.Results：Compared with the model group，the myocardial infarction areas in GB（30，60 mg/kg）groups were significantly decreased；the activity of SOD，GSH-Px and CAT were significantly increased and the activity of MDA was significantly decreased；the level of AST，CPK and LDH in serum were significantly decreased；the myocardial tissue histopathological changes and cardiomyocytes apoptosis were significantly improved；AI in GB （30，60 mg/kg）groups were significantly decreased；the expression of NF-κB was significantly decreased.All of the difference above were significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：GB has inhibitive effects on oxidative stress in the rats with myocardial ischemia-reperfusion injury，which is perhaps related to its effects on reducing myocardial injury after myocardial ischemia-reperfusion.

【Key words】GB；Myocardial；Ischemia-reperfusion；Oxidative stress；Effects

近年来，急性心肌梗死的发病率逐年升高，已经逐渐发展成为危害人类生命健康的主要疾病之一。临床上采取溶栓、介入手术等方法及时恢复血流供应，能够显著降低急性心肌梗死患者死亡率，但再灌注后，缺血再灌注损伤并发症严重影响着患者的预后。研究发现，再灌注后氧自由基的大量产生与过剩而导致的广泛的氧化应激损伤是缺血再灌注损伤发生发展的重要病理基础之一［1］。银杏内酯B（GB）为中药银杏叶的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗感染等多种药理学作用［2-4］。本实验通过制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型并给予GB进行干预治疗，研究GB对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激反应的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD大鼠120只，雄性，8周龄，体质量220～260 g。购自河北省实验动物中心，动物许可证号：SCXK（冀）2013-1-003。温度23～25℃，相对湿度65%～70%，光照周期为12 h︰12 h。

1.2 药物与试剂 GB购自美国Sigma公司，纯度≥90%；注射用盐酸地尔硫，批号1503019，购自天津田边制药有限公司；TTC购自美国Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；HE、TUNEL试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；血清中谷草转氨酶（AST）、磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；NF-κB单抗购自碧云天生物技术有限公司；水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 分组与造模 120只实验用SD大鼠按照随机数字表法随机分为假手术组，模型组，GB高、中、低剂量（15、30、60 mg/kg）组和地尔硫组，每组20只。除假手术组外，其余各组大鼠均参照徐淑云等［5］报道的实验方法制备心肌缺血再灌注大鼠模型。假手术组行手术通路，除不夹闭冠状动脉外，其余操作同手术组。取GB准确称量，用0.9%氯化钠注射液配制成浓度为60 mg/mL的溶液，并依此稀释制备30 mg/mL和15 mg/mL的GB溶液；取地尔硫准备称量并用0.9%氯化钠注射液配制成1 mg/mL的地尔硫溶液；为保证给药容积一致，各治疗均腹腔注射给药1 mL进行治疗。再灌注后，GB各组和地尔硫组立即通过腹腔注射给药1 mL进行治疗，每日1次，疗程7 d，假手术组和模型对照组同步给予1 mL 0.9%氯化钠注射。治疗完成后，行各指标的观察和检测。

1.4 标本采集与检测 1）心肌组织梗死面积的测定。各组大鼠腹腔注射水合氯醛深度麻醉后开胸取心脏组织，-20℃冻存20 min后切片，1%TTC溶液（恒温37℃、避光）孵育15 min，正常组织呈红色、梗死区呈灰白色，采用BI-2000医用图像分析系统分析心肌组织梗死面积。2）生化指标检测。深度麻醉后开腹经腹主动脉取血并离心（1500 r/min，10 min）取血清，按照各试剂盒操作方法依次进行处理，然后通过生化分析仪平行测定各组大鼠血清中AST、CPK、LDH活性。参照“1）方法”取心肌组织，研磨匀浆后经3000 r/min，离心10 min后取上清液，按照试剂盒操作方法依次进行处理，然后通过紫外-可见分光光度计平行测定各组大鼠心肌组织中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。3）心肌组织形态结构改变和心肌细胞凋亡状况的观察及凋亡指数AI的计算。参照“1）方法”取心肌组织，4%多聚甲醛溶液固定72 h后行石蜡包埋，切片和展片处理后，进行HE染色和封片处理，通过光学显微镜观察心肌组织形态结构改变；取石蜡切片，按照TUNEL试剂盒操作方法行染色处理，通过光学显微镜观察心肌细胞凋亡状况。AI的计算：每张染色切片随机选取6个视野，分别计数细胞总数和阳性细胞数，各组分别取平均值后计算AI（%）=（阳性细胞数/细胞总数）×100%。4）心肌组织中NF-κB蛋白表达的检测。取以上制备的心肌组织匀浆液，经12000 r/min，低温（4℃）离心10 min后取沉淀，BCA法蛋白定量后采用Western blot法测定各组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白表达，应用Quantity One软件进行分析。

1.5 统计学处理 应用SPSS15.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织梗死面积比较 见表1。模型组大鼠心肌组织梗死面积较假手术组显著升高 （P＜0.01）。GB中高剂量组和地尔硫组大鼠心肌梗死面积较模型组显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组大鼠心肌组织中抗氧化酶活性和MDA含量比较（±s）

表1 各组大鼠心肌组织中抗氧化酶活性和MDA含量比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

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2.2 各组大鼠心肌组织中抗氧化酶活性和MDA含量比较 见表1。模型组SOD、GSH-Px、CAT活性较假手术组显著降低且MDA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，GB中高剂量组SOD、GSH-Px、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 各组大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比较 见表2。模型组大鼠AST、CPK、LDH含量较假手术组均显著升高 （P＜0.01）；与模型组比较，GB中高剂量组AST、CPK、LDH含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比较（U/L，±s）

表2 各组大鼠血清中AST、CPK、LDH含量比较（U/L，±s）

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2.4 各组大鼠心肌组织形态结构改变 见图1。经HE染色后观察病理切片发现：假手术组大鼠心肌组织形态结构和心肌细胞状态均未见异常；而模型组大鼠呈现心肌纤维紊乱，间质水肿变性，心肌细胞呈空泡变性、胞质着色不均、胞核固缩等明显的病理性形态结构改变；而与模型组比较，GB各组心肌组织病理性形态结构改变呈不同程度改善，其中以GB高剂量量组效果最为显著。

图1 各组大鼠心肌组织形态结构（HE染色，400倍）

2.5 各组大鼠心肌细胞凋亡状况 见图2，表3。模型组心肌细胞凋亡数量较假手术组明显增多；而GB各组心肌细胞凋亡数量较模型组呈不同程度减少，以GB高剂量组最为显著，计算并比较AI发现：与手术组比较，模型组心肌细胞AI显著升高（P＜0.01）；而与模型组比较，GB（30、60 mg/kg）组AI显著降低（P＜0.01）。

2.6 各组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白表达 见图3，

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡状况（HE染色，400倍）

表3 各组大鼠心肌细胞AI、心肌组织NF-κB蛋白表达（±s）

表3 各组大鼠心肌细胞AI、心肌组织NF-κB蛋白表达（±s）

表3。模型组大鼠心肌组织NF-κB蛋白表达较假手术组显著上调（P＜0.01）；与模型组比较，GB中高剂量组NF-κB蛋白表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01），

组别 n假手术组 20模型组 20 GB低剂量组 20 AI（%） NF-κB/β-actin 3.73±1.59 0.15±0.04 58.24±10.51**0.47±0.12**46.07±8.02 0.38±0.10 GB中剂量组 20 39.01±7.23△0.30±0.07△△GB高剂量组 20 27.46±6.28△△0.23±0.06△△地尔硫组20 41.29±8.05△0.33±0.08△

图3 各组大鼠心肌组织NF-κB蛋白表达

3 讨 论

随着人们饮食结构和工作劳动强度的改变，急性心肌梗死发病率逐年升高，目前临床上主要采取溶栓、介入手术等方法及时恢复血流供应，虽能够挽救部分濒死心肌细胞并显著降低急性心肌梗死患者死亡率，但“缺血再灌注损伤”并发症的存在仍严重影响着患者的预后。病理生理学研究发现，再灌注后随着氧的涌入和抗氧化酶活性的降低氧自由基大量产生和过剩，引发广泛的氧化应激损伤可能是心肌缺血再灌注损伤重要的病理机制［1］，因此抑制氧化应激反应或许是降低心肌缺血再灌注损伤的新靶点。

正常生理状态体内生成的氧自由基能够在SOD的催化作用下还原生成H2O2［6-7］，并在GSH-Px或CAT进一步催化还原生成H2O和O2［8-10］，而维持体内氧自由基的动态平衡，所以此3种酶活性能够直接反应机体抗氧化能力；过氧化终产物MDA的含量能够间接反映细胞氧化应激损伤程度。正常状态下血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）活性都非常低，但细胞膜受氧自由基攻击而过氧化损伤后，心肌酶将迅速释放入血，导致血清中含量陡然增高，因此血清中心肌酶含量水平能够准确反映神经细胞受氧自由基损伤程度［11-12］。

氧化应激损伤是细胞凋亡的重要诱发因素之一，而多效能核转录因子NF-κB蛋白被称为连接氧化应激和细胞凋亡的“桥梁”。生理状态下NF-κB以无活性形式存在于胞质中，被氧自由基刺激而活化的NF-κB蛋白能够促进巨噬细胞活化和浸润，诱导促凋亡信号释放而导致细胞凋亡［13-14］；并且被活化的NF-κB进入细胞核后能够与DNA的相应位点结合，参与调控下游相关靶基因的转录表达［15］。

银杏叶为银杏科银杏属多年生落叶乔木银杏的叶，是我国传统中药品种，《本草纲目》和《中药志》中均有记载，其性味甘苦涩平，具有益心敛肺、化湿止泻之功效。现代药学研究发现，萜内酯类化合物为银杏叶的主要有效成分，包括银杏内酯A、B、C、M和白果内酯。研究表明银杏内酯为血小板活化因子（PAF）拮抗剂，活性最强的即为GB，具有抗炎、抗氧化，抗感染等多种药理学作用［2-4］。本实验通过制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型并给予GB进行干预治疗研究发现：GB能够有效改善心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织形态结构改变并降低心肌组织梗死面积；改善抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性、降低MDA含量，降低血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量，下调NF-κB蛋白表达，抑制心肌细胞凋亡，提示GB能够通过抑制氧化应激反应而对心肌缺血再灌注损伤大鼠起到保护作用。

［1］ 韩帅先，姚焕玲，李云云，等.菟丝子提取物对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用［J］.中国药理学通报，2011，27 （4）：533-536.

［2］ Nie ZG，Peng SY，Wang WJ.Effects of Ginkgolide B on lipopolysaccharide-inducedTNFalpha production in mouse peritoneal macrophages and NF-κB activation in rat pleural polymorphonuclear leukocytes［J］.Acta Pharm Sin，2004，39：415-418.

［3］ Zhou LE，Wang WJ，Bai JY，et al.Effects of Ginkgolide B on arachidonic acid metabolizing enzymes and level of intracellular calcium in rat polymorphonuclear leukocytes［J］.Acta Pharm Sin，2001，36（2）：92-95.

［4］ Kitamoto S，Egashira K.Endothelial dysfunction and coronary atherosclerosis［J］.Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord，2004，4（1）：13-22.

［5］ 徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2002：45.

［6］ Lartigue A，Burlat B，Coutard B，et al.The megavirus chilensis Cu，Zn-superoxide dismutase：the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme［J］.J Virol，2014，2588（14）：254-261.

［7］ AKavakc1oɡlu B，Tongul B，Tarhan L.Aqueous two-phase system purification for superoxide dismutase induced by menadione from Phanerochaete chrysosporium［J］.Artif Cells Nanomed Biotechnol，2016，29：1-9.

［8］ Li X，Zhao L，Yue L，et al.Evidence for the protective effects of curcumin against oxyhemoglobin-induced injury in rat cortical neurons［J］.Brain Res Bull，2016，120（6）：34-40.

［9］ Sener U，Uygur R，Aktas C，at al.Protective effects of thymoquinone against apoptosis and oxidative stress by arsenic in rat kidney［J］.Ren Fail，2016，38（1）：117-123.

［10］Ma Q，Li Y，Fan Y，et al.Molecular mechanisms of lipoic acid protection against aflatoxin B-induced liver oxidative damage and inflammatory responses in broilers［J］.Toxins（Basel），2015，7（12）：5435-5447.

［11］Li T，Satomi Y，Katoh D，et al.Induction of cell cycle arrest and p21（CIP1/WAF1）expression in human lung cancer cells by isoliquiritigenin［J］.Cancer Lett，2004，207（1）：27-351.

［12］Ali F1，Naqvi SA2，Bismillah M，et al.Comparative analysis of biochemical parameters in diabetic and non-diabetic acute myocardial infarction patients［J］.Indian Heart J，2016，68 （3）：325-331.

［13］Zhang Q，Huang WD，Lv XY，et al.Ghrelin protects H9c2 cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis through NF-κB and mitochondria-mediated signaling［J］.Eur J Pharmacol，2011，654（2）：142-149.

［14］Zhang X，Sun CY，Zhang YB，et al.Kegan Liyan oral liquid ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury through inhibition of TLR4-mediated NF-κB signaling pathway and MMP-9 expression［J］.J Ethnopharmacol，2016，186（12）：91-102.

［15］Li Q，Xu LS.Mechanism of destruction of islet cells by exogenous nitric oxide［J］.Med J Natl Def Force Northwest China，2002，23（5）：361-363.

The Effects of Ginkgolide B on Oxidative Stress in Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

BAI Zhichao，CHEN Mingchao，LI Hefei.Central Hospital of Handan，Hebei，Handan 056001，China.

R285.5 文献标志码：A

1004-745X（2016）08-1480-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.008

河北省卫生厅重点科技研究计划（20130359）

（电子邮箱：xtrmyyph@163.com）

2016-03-14）