苦参碱对人角膜成纤维细胞细胞周期和凋亡的影响

邓 珍袁满红周珍华刘洪伟（.浙江省杭州市余杭区第一人民医院，浙江 杭州 00；.南华大学附属第二医院，湖南衡阳 400；.天津市第四中心医院，天津 0040；4.重庆市中医院，重庆 4000）

·实验报告·

苦参碱对人角膜成纤维细胞细胞周期和凋亡的影响

邓 珍1袁满红2周珍华3刘洪伟4△
（1.浙江省杭州市余杭区第一人民医院，浙江 杭州 311100；2.南华大学附属第二医院，湖南衡阳 421001；3.天津市第四中心医院，天津 300140；4.重庆市中医院，重庆 400021）

目的 观察苦参碱对体外培养的人角膜成纤维细胞周期和凋亡的影响。方法 将分离培养的人角膜成纤维细胞（HCFs）纯化后，用不同浓度的Mat干预培养的HCFs的生长，并以0.1%地塞米松作为对照，在干预48 h后用流式细胞仪（FCM）检测细胞周期和细胞凋亡。结果 Mat在80 mg/L以下的药物浓度处理HCFs 48 h后，未引起其明显的凋亡率的改变，并能使其细胞周期阻滞于G2/M期。而160 mg/L以上的药物浓度处理HCFs 48 h后，引起明显的细胞凋亡。结论 Mat在80 mg/L以下的浓度范围内，既能阻滞HCFs的细胞周期，又不增加其凋亡的发生率。

苦参碱 角膜成纤维细胞 细胞周期 凋亡

苦参碱（Matrine）是从豆科槐属植物苦豆子、苦参等中分离得到的生物碱，属于四环喹嗪啶类化合物，具有多方面的药理活性和临床功能［1-6］。苦参型生物碱的主要活性成分为C15H24N2O［7-8］，其功效丰富，但最重要的是其抗成纤维细胞增殖作用。激光角膜屈光性手术治疗屈光不正，已经让接受治疗的近视患者获得了较为满意的裸眼视力，但是仍有患者会因为haze的出现而影响视力。研究表明，基质成纤维细胞的过度增殖是引发角膜屈光性手术后haze和屈光回退的原因［9］。

因此，有效地抑制成纤维细胞增殖的药物无疑将会改善激光角膜屈光手术的预后，让患者获得更大的满意度。目前应用于激光角膜屈光手术后抗增殖的药物最常见的是糖皮质激素，但是由于此激素对于眼睛的不良反应，限制了其广泛应用。随着对苦参碱研究的深入，我们有望寻找到一种能替代糖皮质激素的抗成纤维细胞增殖安全有效的药物。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本与试药 南华大学附二医院眼科角膜移植术后剩下的角膜环被用于本课题的研究 （来源是否符合医学伦理委会员审查）。苦参碱（Mat）的标准品：中国药品生物制品检定所。地塞米松（Dxm）的标准品，胰蛋白酶：美国Sigma公司；DMEM培养基：杭州四季青生物工程公司。鼠抗人AE1/AE3单克隆抗体、DAB显色试剂盒：福州迈新生物技术开发有限公司。Ⅱ型胶原酶：武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 仪器 CO2细胞培养箱 （Galaxy）来自美国RSBiotech公司；流式细胞仪来自美国Bechman coulter Epics Altrag型；光学显微镜来自日本尼康公司；倒置相差显微镜来自日本奥林巴斯公司。

1.3 取材与细胞培养 手术无菌台上取下角膜移植后的角膜环，应用PBS液进行三次漂洗，并且对角膜上皮及内皮进行多次刮除，置于0.25%胰酶溶液，在4℃冰箱消化过夜后，将角膜用剪刀剪碎成约1 mm见方的小块，置于2 g/LⅡ型胶原酶溶液中，放置于37℃、95%湿度、5%CO2培养箱内消化4 h，等剪碎的角膜组织块消化后，低速离心（800 r/min，10 min），应用PBS进行1次漂洗加入DMEM培养基 （含胎牛血清20%，青霉素、链霉素均为100 μmol/mL，pH值7.2～7.4），吹打均匀后将细胞悬液接种于培养瓶培养，每3日换培养液1次。

1.4 设计分组 阴性对照组：不加Mat及Dxm。阳性对照组：（Dxm）终质量浓度为1 mg/L。实验组（Mat用药组）：Mat终质量浓度分别为10、20、40、80、160 mg/L。

1.5 细胞周期和细胞凋亡的测定 制备单细胞悬液，将单细胞悬混液在75 mL的培养瓶中接种，将细胞悬液瓶放在37℃、95%湿度、含5%CO2的恒温培养箱中进行培养，1 d后取出，加入不同的条件培养基，进行2 d的培养后，让其消化成单细胞悬液后离心（800 r/min，6 min），放弃上清，应用PBS进行多次清洗，而后进行离心（800 r/min，6 min），再次弃去上清，收集1×106以上的细胞，用终浓度为70%的冰乙醇进行固定，再应用4℃冰箱固定1 d，再次应用PBS漂洗3次，经0.5 g/L的RnaseA消化30 min，终质量浓度65 mg/L的碘化丙锭（PI）染色1 h后流式细胞仪测定，结果用Multicycle软件计算细胞各时期细胞数百分比率，分析细胞周期，计算凋亡率，实验重复3次。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s），比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HCFs的原代培养 胶原酶消化24 h后细胞贴壁，呈梭形，1周左右见细胞数目逐渐增多，10 d后细胞渐融合。角蛋白阳性为角膜上皮细胞，传代3代后，所有的细胞均表现为角蛋白阴性，则表明成纤维细胞中没有角膜上皮的污染。见图1。

图1 HCFs图片（200倍）

2.2 Mat对HCFs周期和凋亡的影响 见表1。流式细胞仪检测结果表明，10、20、40、80、160 mg/L Mat作用于HCFs 48 h后，与阴性对照组相比：G0/G1期的细胞数目虽稍有增加，但与阴性对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；而G2/M期的细胞数目增加，S期细胞数目减少，与对照组比较均差异有统计学意义（P＜0.05）；随着Mat浓度的增加，G2/M期的细胞数目进一步增加，而S期细胞数目明显减少，这表明Mat对HCFs的细胞周期分布具有显著调节作用。Dxm组与阴性对照组相比，G0/G1期明显增加，S期明显减少差异有统计学意义（P＜0.05），而G2/M期差异无统计学意义（P＞0.05）。流式细胞仪检测结果也表明，浓度为160 mg/L 的Mat作用细胞后可以引起明显细胞凋亡（P＜0.05），而小于 80 mg/L的浓度则差异无统计学意义 （P＞0.05）。DNA指数（DI）在各药物浓度组间差异未有统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 Mat和Dxm对HCFs细胞周期的影响（±s）

表1 Mat和Dxm对HCFs细胞周期的影响（±s）

与Dxm组比较，*P＜0.05；与阴性对照组比较，△P＜0.05。下同。

组别n S阴性对照组 3 29.13±0.65 Dxm（1 mg/） 3 15.57±0.95△Mat（10 mg/） 3 24.13±1.04*△G0/G1 G2/M 60.50±1.70 11.40±0.66 72.67±1.47△11.77±0.90 59.63±1.16*16.23±1.38*△Mat（20 mg/） 3 23.30±1.59*△60.97±2.39 15.73±1.40*△Mat（40 mg/） 3 62.13±1.91 17.60±2.59*△20.23±3.39*△Mat（80 mg/） 3 61.53±3.66 19.80±1.81*△18.67±1.15*△Mat（160 mg/） 3 64.60±3.86 23.00±1.71*△12.57±1.37*△

表2 Mat和Dxm对HCFs细胞凋亡的影响（±s）

表2 Mat和Dxm对HCFs细胞凋亡的影响（±s）

组别 n阴性对照组 3 Dxm（1 mg/） 3 Mat（10 mg/） 3 Apotosis（%） DI 1.78±0.37 1.01±0.01 1.51±0.34 1.02±0.00 1.88±0.33 1.02±0.03 Mat（20 mg/） 3 2.08±0.26 1.01±0.02 Mat（40 mg/） 3 1.99±0.28 1.01±0.03 Mat（80 mg/） 3 2.21±0.44 1.02±0.04 Mat（160 mg/） 3 8.64±1.21*△1.01±0.02

3 讨 论

近年来随着激光角膜屈光性手术技术的发展，其治疗效果已经得到广泛认同［10］。越来越多的人愿意选择激光手术，但是术后haze的出现仍然是个不容忽视的问题。目前临床上激光角膜屈光性手术后经常应用皮质类固醇，但可引起高眼压症、继发性青光眼、并发性白内障的危险。为了减少这些不良反应，近年来全球对haze的发有了很多的研究［11-13］。

Wilson撰文表明，角膜的上皮损伤是造成角质膜细胞凋亡的主导原因，所以角膜愈合反应的启动因素是角膜细胞的凋亡［14］。总之，角膜成纤维细胞的增殖直接促成了haze的形成［15］。所以，预防激光角膜屈光性手术后haze的形成的有效方法是阻断其增殖，从而提高手术的疗效。

脱离了正常生存环境、在人体外培养的角膜基质成纤维细胞可以自行进行增殖，与体内不同，而与在体激活的角膜基质成纤维细胞极其相似。角膜成纤维细胞在传代后可获大量细胞供研究使用，通过观察Mat对体外培养的人角膜纤维细胞增殖的影响，来近似地了解苦参碱应用于体内激活角膜成纤维细胞的作用，为该药的应用提供一定的实验依据。

本实验将10、20、40、80、160 mg/L的Mat和1 mg/L 的Dxm分别同时作用于HCFs 48 h后，用流式细胞仪分析了细胞周期和凋亡的变化，其结果显示：1）低于160 mg/L浓度的Mat作用于HCFs 48 h后，G2/M期的细胞数目增加，S期细胞数目明显减少，说明Mat使成纤维细胞合成DNA减少，同时还干扰有丝分裂前的准备，阻碍有丝分裂的进行。而Dxm则表现为G0/G1期细胞数目的增加，主要是抑制DNA的合成。2）DNA指数（DI）是衡量细胞是否为二倍体的一个指标。在正常二倍体细胞中，DI值为（1.01±0.1）。当DI＞1.1，表示细胞是异倍体；而当DI＜0.9时，则为测试误差。由DI指数来看，上述各组浓度Mat之间均未见显著性差异，说明160 mg/L以下的质量浓度对细胞没有致畸变作用。3）药物在80 mg/L以下时，对HCFs不产生明显的凋亡，也就不会因为该细胞的过度凋亡而启动角膜的过强愈合反应。

Haze的形成主要原因是角膜成纤维细胞的增殖，所以我们所寻找的激光角膜屈光性手术后用药必须是能抑制该细胞增殖的药物，但是同时却不能引起该细胞的凋亡，因为角膜组织不同于人体其他组织，各种原因所致的角膜成纤维细胞的凋亡反过来又会启动角膜创面的愈合反应，就此引起级联反应，导致更多的角膜成纤维细胞增殖，从而影响激光角膜屈光性手术的疗效。

为了解决该矛盾，我们在发现了苦参碱对人角膜成纤维细胞呈时间-剂量依赖性抑制增殖后，还必须要筛选出合适的药物作用浓度，在保证药物有效抑制增殖的同时而不诱导明显的凋亡。但是笔者在该实验中是对体外培养的人角膜成纤维细胞所做的处理，可能具体的药物浓度还是会跟临床用药有所差异，故而该实验结果还需进一步的动物实验来完善。所以Mat是一种有可能成为极具潜力的激光角膜屈光性手术后的新型候选药物，但其抑制增殖的机制和适宜的临床用药浓度还有待于更深入的研究。

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R969 文献标志码：A

1004-745X（2016）08-1549-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.029

（电子邮箱：1046195437@qq.com）

2016-03-23）