TNBS模型大鼠结肠组织中NF-κB、PPAR-γ的表达特点*

顾培青 沈 洪朱 磊 刘亚军 张 露 刘军楼 徐 艺 成家飞（江苏省中医院，江苏 南京 210029）

·研究报告·

TNBS模型大鼠结肠组织中NF-κB、PPAR-γ的表达特点*

顾培青 沈 洪△朱 磊 刘亚军 张 露 刘军楼 徐 艺 成家飞
（江苏省中医院，江苏 南京 210029）

目的 观察三硝基苯磺酸 （TNBS）造模后第3日、7日、10日、14日大鼠结肠组织中核转录因子-κB （NF-κB）、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）表达的变化特点。方法 造模组采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型，将大鼠分为空白组、造模后3 d组、造模后7 d组、造模后10 d组、造模后14 d组。后4组分别于造模后第3日、7日、10日、14日处死，采用免疫组化法及实时荧光定量PCR法测定各组大鼠结肠组织中NF-κB、PPAR-γ及mRNA表达。结果 造模后3 d大鼠结肠NF-κB表达显著上调，10 d、14 d后表达较前逐渐回落；造模后3 d大鼠结肠PPAR-γ表达明显下调，至14 d时其表达逐渐恢复。结论 TNBS大鼠结肠炎是炎症性肠病的良好模型，造模后结肠NF-κB表达上调，PPAR-γ表达受抑制，在造模后14 d后模型自愈较为明显，治疗的疗程选择7～10 d为宜。

三硝基苯磺酸 炎症性肠病 核转录因子-κB 过氧化物酶体增殖物激活受体-γ

【Abstract】Objective：To observe the expression characteristics of NF-κB and PPAR-γ in colon tissue of TNBS rats after successful modeling on 3rdday，7thday，10thday and 14thday.Methods：The models were made with TNBS/ethanol solution enema method.The rats were divided into the blank group，3 d group，7 d group，10 d group and 14 d group.The latter four groups were killed according to time.The expression of NF-κB，PPAR-γ and mRNA was detected by immunohistochemistry and real-time fluorescence quantitative PCR method.Results：3 days after modeling，NF-κB expression of rat colon was significantly up-regulated，but after 10 days and 14 days，the expression gradually declined.3 days after modeling，PPAR-γ expression of rat colon significantly reduced.Till 14thday，the expression gradually restored.Conclusion：TNBS colitis in rats is a good model of IBD.After modeling，NF-κB of colon up-regulated and PPAR-γ expression was inhibited.14 d after modeling，selfhealing of model is more obvious，and the course of treatment lasting 7 to 10 days is appropriate.

【Key words】TNBS；Inflammatory bowel disease；NF-κB；PPAR-γ

炎症性肠病（IBD）主要包括溃疡性结肠炎（UC）和克隆氏病（CD），是一组与遗传、环境、免疫等因素相关的慢性肠道炎症性疾病。目前的动物模型研究多种多样，造模方法主要有药物学方法、免疫学方法、特定基因敲除、基因缺陷、T细胞移植等等，其中免疫模型是IBD目前研究最活跃的领域。三硝基苯磺酸（TNBS）作为一种半抗原，用它诱导的大鼠实验性结肠炎模型是研究IBD的经典模型。核转录因子-κB（NF-κB）作为炎症反应的枢纽，在IBD的发病机制中被广泛研究。近年来发现，结肠黏膜表面免疫细胞能够表达过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ），并通过调节核转录因子激活蛋白1、NF-κB等炎症相关转录因子的表达来调节炎症反应［1］。其活化后参与体内炎症反应、免疫反应和表皮细胞的分化，尤其与IBD的发病机制和严重程度密切相关［2］。本实验观察TNBS造模后第3、7、10、14 d大鼠结肠组织中NF-κB、PPAR-γ表达的变化特点，既是对TNBS结肠炎模型的验证，也为进一步研究提供数据参考。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，鼠龄3～4个月，体质量（200±20）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物合格证编号2008001652254。

1.2 试剂与仪器 5%TNBS水溶液：Sigma公司，批号PP2297；DAB显色试剂盒（20X）（福州迈新生物技术开发有限公司，批号1409030031）；KIT-9921即用型免疫组化试剂盒（鼠/兔）（福州迈新生物技术开发有限公司，批号 1411249921）；Trizol（Takara公司，批号9109）；Sybr green（Toyobo公司，批号43300）ELISA试剂盒 （中国Elabscience公司），Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo公司），光学显微镜 （日本Olympus公司），Stepone plus荧光定量PCR （美国ABI公司），ABI-Veriti型普通PCR仪（美国ABI公司）。

1.3 模型复制 按完全随机设计法将大鼠分为空白组、造模后3 d组、造模后7 d组、造模后10 d组、造模后14 d组。造模组采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型［3］。大鼠10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉；用直径2.0 mm长12 cm的输液管经液体石蜡润滑后，由大鼠肛门轻缓插入深约8.0 cm处一次性推入TNBS造模溶液 （100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 mL），捏紧肛门提尾倒立1 min后放回笼中自然苏醒，常规饲养。空白组大鼠予上述方法等量生理盐水灌肠。

1.4 标本采集与检测 1）标本采集。分别于造模后3、7、10、14 d脱颈椎法处死大鼠，立即开腹迅速剖取结肠，自肛门2 cm处向上取结肠6～8 cm，沿肠系膜纵轴剪开肠腔，冷0.9%氯化钠注射液冲洗干净，立即进行大体形态评分。取病变最严重处结肠，一部分置4%甲醛中固定，石蜡包埋、切片（4 μm）、HE染色，光镜下观察组织病理学变化。另一部分立即置于液氮中，后转入-80℃冰箱中保存。2）大鼠结肠病理组织学评分。评分标准：（1）肠壁炎症的严重程度，记为1分、2分、3分，分别代表轻度、中度、重度炎症；（2）病变严重程度（累及部位），记为1分、2分、3分，即病变位于黏膜层，黏膜和黏膜下层，或透壁性损伤；（3）隐窝损害程度，记为1分、2分、3分、4分。即1/3隐窝损害，2/3隐窝损害，隐窝缺失、表面上皮完整，隐窝和表面上皮都缺失。上述3项指标的打分再分别乘以病变区域所占比例（参与比例）为最后得分。无明显病变记为0分，累加所有分数，得出总分。3）免疫组化法检测肠组织NF-κB、PPAR-γ表达。切取大鼠组织，固定、常规二甲苯脱脂，梯度酒精脱水、透明、包埋、切片。石蜡切片常规脱蜡、水化，用3%H2O2处理阻断内源性过氧化酶并孵育10 min，PBS冲洗3×5 min；微波抗原修复，正常血清工作液于37℃封闭10 min，再用一抗（稀释100倍）4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3×5 min；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min；DAB显色，自来水充分冲洗后、苏木素复染、常规脱水、二甲苯透明、干燥，树脂封片。生物显微图像分析系统（复日，FR-988 Smart Scape2000）摄像、标记、分析。4）实时荧光定量PCR法检测肠组织NF-κB、PPAR-γ mRNA表达。（1）抽提总RNA：按RNAiso Reagent操作说明书提取TNBS模型大鼠结肠黏膜组织总RNA，紫外分析及电泳检测总RNA的纯度、浓度及完整性。（2）单链cDNA的合成：采用Prime Script TM RTreagent Kit试剂盒，严格按说明书操作。各目的基因的引物序列、产物大小如下。GAPDH：F-GGTGTGAACCACGAGAAAT ATGAC，R-TCATGAGCCCTTCCACAATG，扩增片段长度127 bp。PPAR-γ：F-GACCTGAAGCTCCAAGAATACC，R-TTCATGTGGCCTGTTGTAGAG，扩增片段长度99 bp。NF-κB P65：F-GCTCAAGATCTGCCGAGTAAA，R-GT CCCGTGAAATACACCTCAA，扩增片段长度113 bp。（3）RT-PCR：采用SYBR Premix ExTaqTM试剂盒，在ABI7300上设置检测文件，反应条件如下：预变性：95℃，10 min（1个循环），PCR反应：95℃，5 s；60℃，1 min（40个循环）。使用Sequence Detection software version1.2.3软件分析PCR过程中样本的Ct（循环阈值），Ct值随模板浓度增大而减少。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，方差分析，最小显著差法（LSD）进行两两比较，双侧检验以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠结肠病理组织学评分比较 见表1。图1。经单因素方差分析两两比较，与空白组相比，造模后3 d大鼠结肠病理评分显著升高 （P＜0.05）；3、7、10 d之间病理评分差异无统计学意义（P＞0.05）；14 d病理评分较3 d有明显下降（P＜0.05），与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠结肠病理组织学评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠结肠病理组织学评分比较（分，±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与造模后3 d组比较，#P＜0.05。下同。

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2.2 各组大鼠肠组织NF-κB表达的比较 见表2。图2。经单因素方差分析两两比较，与空白组相比，造模后3 d大鼠结肠NF-κB免疫组化IOD值明显增高 （P＜0.05）；造模后10、14 d较3 d大鼠结肠NF-κB免疫组化IOD值有明显降低（P＜0.05）。

2.3 各组肠组织PPAR-γ表达的比较 见表3，图3。经单因素方差分析两两比较，造模后3 d大鼠结肠PPAR-γ免疫组化IOD值明显下降（P＜0.05）；造模后14 d较 3、7、10 d大鼠结肠 PPAR-γ免疫组化IOD值均有明显增加（P＜0.05）；造模后3、7、10 d之间PPAR-γ免疫组化IOD值差异无统计学意义（P＞0.05）。14 d与空白对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 大鼠结肠病理图片（HE染色，100倍）

表2 各组大鼠结肠组织NF-κB免疫组化IOD值比较（±s）

表2 各组大鼠结肠组织NF-κB免疫组化IOD值比较（±s）

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图2 大鼠结肠组织NF-κB免疫组化表达情况（200倍）

表3 大鼠结肠组织PPAR-γ免疫组化IOD值（±s）

表3 大鼠结肠组织PPAR-γ免疫组化IOD值（±s）

与造模后7 d组比较，△P＜0.05；与造模后10 d组比较，▲P＜0.05。

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图3 大鼠结肠组织PPAR-γ免疫组化表达情况（200倍）

2.4 各组大鼠肠组织NF-κB mRNA表达的比较 见表4。经单因素方差分析两两比较，造模后3 d NF-κB mRNA 2-ΔΔCt值明显升高（P＜0.05）；7 d、14 d组NF-κB mRNA 2-ΔΔCt值较3 d组有降低（P＜0.05）。

2.5 各组大鼠肠组织PPAR-γ mRNA表达的比较见表4。经单因素方差分析两两比较，各组间PPAR-γ mRNA 2-ΔΔCt值差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组大鼠肠组织NF-κB mRNA、PPAR-γ mRNA表达的比较（±s）

表4 各组大鼠肠组织NF-κB mRNA、PPAR-γ mRNA表达的比较（±s）

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3 讨 论

Morris在1984年首次成功地制造出三硝基苯磺酸（TNBS）动物模型，该模型建立之初用于反映CD的病理变化及药物疗效的研究［3］。随后，人们将其用于UC的病理研究和药效评价［4］。该模型主要采用灌肠给予以乙醇为溶剂的TBNBS溶液，刺激结肠炎的产生。其机制被认为首先是乙醇破坏鼠的肠黏膜屏障，TNBS作为半抗原与体内蛋白结合成为抗原，产生一系列免疫反应，从而诱发结肠炎症。通过对不同剂量的TNBS引起的大鼠UC模型观察［5］，发现一次性注入直肠100 mg/kg剂量下引起的结肠组织呈慢性炎症变化，病程较长，各种炎症介质发生明显变化，肠黏膜发生溃疡、水肿、糜烂、大量的炎性细胞浸润等组织病理学改变，与UC患者出现的临床表现和病理变化十分相似。所以学界认为100 mg/kg是本模型的最佳剂量，与国外报道相似［6-8］。TNBS（100 mg/kg）造模后，结肠炎持续约7～8周时间，急性期主要限于结肠黏膜及黏膜下层大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主；慢性期主要为淋巴细胞和浆细胞浸润，病理改变以血管增生和组织变形为突出表现；急、慢性期的大致分界点为3周左右［9-10］。IBD实验一般用其急性期，以模仿IBD活动期的特征。本实验观察至大鼠造模后14 d为止，观察其急性期内结肠组织NF-κB及PPAR-γ表达变化特征，结果显示：造模后3 d病变累及肠壁各层，局部有多量坏死的中性粒细胞积聚，见黏膜层隐窝坏死，轮廓存留，1只隐窝轻度损伤，2只见黏膜层坏死，未见明显炎细胞浸润，损伤局部组织无明显肉芽组织增生。造模后7 d多数黏膜层全部坏死，损伤局部组织有明显肉芽组织增生。黏膜层隐窝坏死，2只隐窝中度损伤。造模后10 d组病变炎症程度与7 d组基本相似。造模后14 d组肠壁有重度炎症反应，损伤局部组织有明显肉芽组织增生，病变累及黏膜下层、肌层，见黏膜层隐窝坏死。经单因素方差分析两两比较显示，造模后3 d、7 d、10 d之间病理评分差异无统计学意义；造模后14 d组病理评分较3 d组有明显改善P=0.030，提示造模后14 d时大鼠结肠炎症已趋于缓解。

NF-κB是一类能与多种基因启动子或增强子部位B位点发生特异性结合并促进其转录的蛋白质。NF-κB可以调控任何含有B位点的基因转录，包括细胞因子及其受体 （IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-2R）、粘附分子（ICAM-1、VCAM-1）、促进或抑制凋亡蛋白（Bcl-xL、Fsa、FasL）、急性期反应蛋白（CRP）、趋化因子（RANTFS、MCP、MTP）、补体、生长因子、酶分子、转录因子等。研究表明［11］，NF-κB在UC中呈现过度激活状态，并导致细胞因子及黏附分子等过度和持续表达，放大炎症反应。NF-κB在许多炎症反应中发挥枢纽作用，尤其是NF-κB p65亚群，它在调控靶基因的转录中起着关键性的作用。Rogler等［12］采用特异性的p65单克隆抗体，原位证实了UC患者肠黏膜巨噬细胞和上皮细胞NF-κB p65表达比正常对照明显增强，且其表达与炎症的严重程度呈正相关。

本实验免疫组化结果显示，造模后3 d大鼠结肠NF-κB表达显著上调，10 d、14 d后表达较前逐渐回落；实时荧光定量PCR结果与免疫组化结果类似。

PPAR是一类配体激活的核转录因子超家族成员，有α、β、γ三个亚类。PPAR-γ主要在棕色和白色脂肪组织、大肠、视网膜以及部分免疫系统表达，参与调控脂质代谢、胰岛素敏感性、细胞增殖以及炎症等多项生物功能［13］。研究表明，PPAR-γ是固有免疫和获得性免疫的关键因子，UC活动期表达低于正常并且与UC严重程度成负相关［14］。5-ASA是治疗UC的经典药物之一，实验证实它可能通过激活PPAR-γ起治疗作用［15］。现在学界认为PPAR-γ的配体通过抑制NF-κB的活化，减少促炎症细胞因子的转录及表达，从而下调过度的免疫反应。

本实验免疫组化结果显示，造模后3 d大鼠结肠PPAR-γ表达明显受到抑制，至14 d时其表达逐渐恢复。实时荧光定量PCR检测PPAR-γ mRNA结果各组间差异无统计学意义，可能与数据标准差较大、抽样误差较大有关，扩大样本量后应会表现出类似免疫组化的结果。

以上可知，观察治疗措施对TNBS模型的干预效果，其疗程选择在7～10 d为宜，疗程过长，如超过14 d，则无法排除模型本身自愈的可能。

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The Expression Characteristics of NF-κB and PPAR-γ in Colon Tissue of TNBS Rats

GU Peiqing，SHEN Hong，ZHU Lei，et al.Jiangsu Hospital of TCM，Jiangsu，Nanjing 210029，China.

·研究报告·

R285.5 文献标志码：A

1004-745X（2016）08-1461-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.002

国家自然科学基金委员会青年科学基金项目（81302919）；江苏省中医药局科技项目立项计划（LZ13048）；江苏省中医院高峰学术人才培养工程（k2014yrc13）；江苏省中医院院级课题（Y14076）

（电子邮箱：shenhong999@163.com）

2016-04-24）