DEHP、MEHP对小鼠胚胎干细胞细胞毒性的研究

2016-09-20 04:58李玉秋段志文裴秀丛张玉敏马明月
实用药物与临床 2016年8期
关键词:邻苯二甲酸培养液胚胎

李玉秋,段志文,裴秀丛,张玉敏,马明月



·论著·

DEHP、MEHP对小鼠胚胎干细胞细胞毒性的研究

李玉秋,段志文,裴秀丛,张玉敏,马明月*

目的分析不同浓度的邻苯二甲酸二乙基己酯[di (2-ethylhexyl) phthalate,DEHP] 及其活性代谢产物邻苯二甲酸单乙基己基酯[mono (2-ethylhexyl) phthalate,MEHP)对小鼠胚胎干细胞细胞毒性、增殖的影响。方法用含有不同浓度DEHP (1 000、100、10、1、0.1、0.01 μmol/L)、MEHP (1 000、100、10、1、0.1、0.01 μmol/L)的培养液,对胚胎干细胞进行培养,用CCK-8法检测细胞活性。结果染毒96 h后,高剂量(1 000 μmol/L) DEHP、MEHP均对胚胎干细胞的增殖有抑制作用(P<0.05),且染毒剂量与细胞抑制率之间存在明显的正相关性,相关系数分别为0.51、0.62 (P<0.05)。结论在一定浓度范围内,DEHP及MEHP均对小鼠ESC具有细胞毒性,且有浓度依赖性。

DEHP;MEHP;小鼠胚胎干细胞;细胞毒性

0 引言

邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di (2-ethylhexyl) phthalate,DEHP]作为可塑剂,全球年产量达300~400万吨[1],广泛应用于包装材料、医疗用品、儿童玩具以及化妆品等制造行业[2]。DEHP仅依靠分子间的作用力,而非化学键实现与塑料主体基质的结合,因此可以不断地从塑料制品中游离出来[3],污染空气、土壤、水源甚至食物。可经消化道、肺和皮肤吸收进入人体,以消化道吸收为主。另外,DEHP还可以通过输液、透析等途径直接进入血液[4];甚至能通过胎盘屏障直接作用于胎儿,影响胎儿发育[5]。DEHP在进入机体后,经酶作用水解为活性代谢产物邻苯二甲酸单乙基己基酯[Mono(2-ethylhexyl) phthalate,MEHP]而被吸收,威胁人类的健康。随着干细胞研究的发展,具有无限增殖、自我更新特性[6]的胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC),因其能灵敏、准确地评价毒物的毒性作用,而被广泛应用于各种研究中。本研究使用不同浓度的DEHP及其活性代谢产物MEHP培养小鼠ESC,研究DEHP和MEHP对小鼠ESC的细胞毒性。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞小鼠ESC M1细胞系、小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryo fibroblasts,MEF) (C57/BL6,P3 辐照后)均购自中国上海斯丹赛生物技术有限公司。

1.1.2仪器和试剂SeriesII 3 110 CO2培养箱(美国Thermo公司)、超净工作台(中国北京东联哈尔仪器制造有限公司)、倒置显微镜(中国北京欣惠泽奥科技有限公司)、ST 16离心机(德国Thermo公司)、酶标仪(美国Molecular Device公司)。DEHP(纯度:99%,美国Sigma公司);MEHP(纯度:98%,美国Pharmachem公司);小鼠ES细胞完全培养基、小鼠ES细胞分化培养基、AP染色液试剂盒(中国上海斯丹赛生物技术有限公司);基础培养基(DMEM/F12,美国HyClone);胎牛血清(美国Biochrom);青霉素-链霉素(美国Biological Industries公司);二甲基亚砜(美国Sigma公司);明胶(美国Sigma公司);CCK-8 细胞活性试剂盒(日本Dojindo公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠ESC的复苏与培养T25培养瓶中加入1 mL明胶,使其平铺培养瓶底,37 ℃、5%CO2温箱中培养20 min以上,吸弃明胶,加4 mL含10%FBS的MEF培养基备用。从液氮中取出MEF细胞冻存管,37 ℃水浴锅中快速解冻并不断摇动。冻存管消毒后,将全部的细胞悬液移入之前备好的培养瓶中。放于37 ℃、5%CO2温箱培养2 d,制成滋养层细胞。滋养层细胞长成熟后,将培养液吸弃,用1 mL小鼠ESC完全培养液清洗1遍,快速复苏小鼠ESC并种入(方法如前),补加小鼠ESC完全培养液至4 mL,在37 ℃、5%CO2温箱培养。每天换液,培养5~7 d,ESC可进行传代。

1.2.2小鼠ESC的鉴定显微镜观察ESC的生长及形态特征。

碱性磷酸酶(AP)染色:①吸出细胞培养液,用PBS润洗2~3次;②用4%多聚甲醛固定1~2 min,吸出固定液,用PBS洗2次;③吸出PBS,用TBST润洗2次;④准备碱性磷酸酶试剂:溶液A(白瓶盖)∶溶液B(绿瓶盖)∶溶液C=50 μL∶12.5 μL∶437.5 μL;⑤吸弃TBST溶液;⑥加入足量的染色试剂使染色液能足够覆盖孔底,室温避光放置15~20 min;⑦吸出染色液,用PBS缓冲液润洗1次,最后保存于PBS溶液中,显微镜下观察染色结果(未分化细胞染色为蓝/紫色,分化的细胞染色为无色)。

1.2.3DEHP、MEHP的配制将DEHP、MEHP分别溶解于DMSO中,用小鼠ESC分化培养基稀释得到浓度为10 000 μmol/L的母液(DMSO含量为1%)。之后分别稀释出含DEHP、MEHP浓度为1 000、100、10、1、0.1 μmol/L的培养液。同时用小鼠ESC分化培养基配置含1% DMSO的培养液作为对照。

1.2.4小鼠ESC细胞活性检测用0.25%胰酶将处于对数生长期的小鼠ESC消化,收集细胞。用小鼠ESC分化培养基将细胞稀释为10×104个/mL,以100 μL/孔种于96孔板中。温箱培养24 h贴壁后,将含不同浓度DEHP、MEHP及1% DMSO的培养液以10 μL/孔加入到96孔板中,每个剂量设3个复孔。温箱培养96 h后,加入CCK8 (10 μL/孔),温箱继续培养3 h,于酶标仪450 nm波长处测吸光度OD值。第3天换液。

2 结果

2.1小鼠ESC的鉴定在倒置显微镜观察下,小鼠ESC在MEF为支持的滋养层细胞上呈克隆生长,边缘清晰,细胞聚集紧密,如图1。将处于对数生长期的ESC,用碱性磷酸酶(AP)染色试剂盒染色,未分化的ESC呈蓝紫色细胞团,而分化的细胞未着色,见图2。

图1 小鼠ESC、MEF细胞生长状况

图2 小鼠ESC的碱性磷酸酶染色

2.2DEHP、MEHP对小鼠ESC增殖的影响与对照组相比,DEHP、MEHP对小鼠ESC染毒96 h后,高剂量(1 000 μmol/L)组的吸光度值均显著下降(P<0.05),见表1。细胞抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。高剂量(1 000 μmol/L)的DEHP、MEHP对小鼠ESC抑制作用明显增强(P<0.05),见表1。

表1 DEHP、MEHP对小鼠ESC细胞增殖及细胞抑制率的影响(n=3)

注:*与对照组比较,P<0.05

2.3不同浓度DEHP、MEHP对小鼠ESC细胞活性抑制作用的相关性DEHP、MEHP的染毒剂量与小鼠ESC受到的抑制作用呈显著的正相关性,相关系数分别为0.51、0.62 (P<0.05),见表2。即随着染毒剂量的增加,DEHP、MEHP对小鼠ESC活性的抑制作用增强,存在明显的剂量依存关系。

表2 不同浓度DEHP、MEHP与小鼠ESC细胞抑制率的相关性

3 讨论

ESC是指受精卵分裂发育成囊胚时,从内细胞团(Inner cell mass)[7]分离出的细胞,具有无限增殖、自我更新的特性,无论是在体内还是体外环境,都能被诱导分化为机体几乎所有类型的细胞[6]。由于ESC具有全能性,且在体外连续传代并保持未分化状态,以及对受试物作用反应迅速、敏感性高、干扰因素少等优点[8],是较好的体外替代试验的生物材料。

自1981年Evans等[9]首次发现并分离小鼠ESC,1998年Thomson等[10]成功分离人类ESC,研究者们已经进行了大量的ESC研究,并且成功地建立了大鼠、小鼠、灵长类等多种动物的ESC细胞系[11]。这些细胞系中,小鼠、猴和人类的ESC细胞系可以在体外长期增殖并保持未分化状态[12],其中小鼠ESC体外分离培养更为简单易行[13],其培养方法也较为完善。Evans等[9]以STO细胞作为饲养层,Wobus等[14]以小鼠原代胚胎成纤维细胞(Primary embryonic fibroblast,pMEF)为分化抑制物,Nihcol等[15]在培养基中添加LIF作为分化抑制剂,由此可见,目前小鼠ESC培养技术已经基本成熟,并得到了广泛应用。

DEHP是具有第2类生殖毒性的邻苯二甲酸酯类物质,已被列入优先控制的污染物名单中[16]。其急性毒性较弱,但动物实验发现,DEHP及其代谢产物MEHP对发育中及成年动物的心、肝、肺、肾及生殖系统等多种组织系统均能产生广泛的慢性毒性作用,甚至具有致畸性、致突变性和致癌性[17]。Shi等[18]报道,高剂量(1 000 μmol/L)的MEHP能抑制人ESC细胞增殖,具有明显的细胞毒性。本研究发现,高剂量的DEHP、MEHP均能抑制小鼠ESC的细胞活性。Lim等[19]报道,1 000 μmol/L MEHP可使小鼠胚胎干细胞的细胞活性明显降低,与本研究结果一致。笔者研究发现,DEHP、MEHP的染毒剂量与细胞抑制率存在剂量依赖关系,与Janer等[20]关于MEHP对胚胎生长有浓度依赖性的研究结果一致。

本研究发现,高剂量的DEHP、MEHP均能抑制小鼠ESC的活性,具有细胞毒性,且存在剂量依赖关系,但其作用机制还需进一步研究。

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Effect of DEHP and MEHP on the cytotoxicity of embryonic stem cell of mouse

LI Yu-qiu,DUAN Zhi-wen,PEI Xiu-cong,ZHANG Yu-min,MA Ming-yue*

(Department of Toxicology,School of Public Health,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China)

ObjectiveTo investigate the effect of di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) and mono (2-ethylhexyl) phthalate (MEHP) on the cytotoxicity of mouse embryonic stem cells (mESC).MethodsmESC was cultured in the culture media of DEHP (1 000,100,10,1,0.1,0.01 μmol/L) and MEHP (1 000,100,10,1,0.1,0.01 μmol/L).Cell viability was evaluated by CCK8.ResultsThe inhibition rate of 1 000 μmol/L of DEHP and MEHP on mESC after 96 h increased significantly (P<0.05).In addition,the inhibition rate was correlated with the concentration of DEHP and MEHP positively,the correlation coefficient being 0.51 and 0.62 respectively (P<0.05).ConclusionDEHP and MEHP both have dose-dependent cytotoxicity on mESC.

DEHP;MEHP;mESC;Cytotoxicity

2016-03-14

沈阳医学院公共卫生学院毒理学教研室,沈阳 110034

沈阳市科技局项目(F14-158-9-22);辽宁省教育厅一般项目(L2014414)

10.14053/j.cnki.ppcr.201608001

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