lncRNA TP73-AS1对肝细胞癌细胞HepG-2凋亡的影响及其机制

张会瑞，焦军东



lncRNA TP73-AS1对肝细胞癌细胞HepG-2凋亡的影响及其机制

张会瑞，焦军东*

目的探讨肝癌中长链非编码RNA TP73-AS1差异表达，及其对肝癌细胞凋亡的影响与作用机制。方法从TCGA数据库中下载并处理新一代测序(RNASEQ)数据，利用生物信息学方法获取显著的肝癌相关lncRNA与mRNA的共表达网络。将差异表达lncRNA映射入上述网络中，利用生物信息学方法预测肝癌相关lncRNA及其功能。通过MTT、AO/EB、Western blot方法对其功能学进行研究。结果共识别25 439对显著的lncRNA-gene共表达关系。在22个差异的lncRNAs被映射中，TP73-AS1度最高，该lncRNA的62个互作基因映射到病毒致癌作用(Viral carcinogenesis pathway)通路中，并能影响下游MAPK信号通路与p53信号通路。lncRNA TP73-AS1-siRNA影响HepG-2细胞增殖，上调促凋亡蛋白Bax表达，增加Caspase-3活性，下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，使p53蛋白表达升高。结论lncRNA TP73-AS1通过p53途径调节肝细胞癌细胞系HepG-2凋亡，为长链非编码RNA成为临床肝细胞癌患者的有效治疗药物提供了实验依据。

长链非编码RNA；共表达网络；肝细胞癌；凋亡

0　引言

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HC)是全世界最常见的恶性肿瘤之一，每年约有60万患者被诊断出患有肝细胞癌[1]。目前，对于肝细胞癌的治疗主要是手术切除、肝脏移植、放化疗等[2]，但仅有20%的患者能够被治疗[3-4]。我国肝细胞癌年死亡率占肿瘤死亡率的第2位[5]。肝细胞癌的病因及发病机制尚未确定[6]，因此，寻找新的肝细胞癌的治疗方法是研究重点。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录长度超过200核苷酸的RNA[7-8]，其本身并不编码蛋白或很少有编码蛋白质的功能[9]。相关研究表明，与正常组织比较，lncRNA在某些肿瘤，如胆囊癌[10]、肝癌[11]、喉癌[12]、胃癌[13]等的肿瘤组织中的表达具有显著差异，这些异常表达的lncRNA可能在染色质修饰、X染色体失活、转录、翻译、基因印记、剂量补偿效应、蛋白质的活性调控及RNA的可变剪切调控等过程中发挥作用[14-15]。但是，关于lncRNA与肝细胞癌的研究并不完善。

本文利用生物信息学数据库与计算方法首先预测了肝细胞癌相关的lncRNA，筛选出表达量最高的lncRNA TP73-AS1；研究lncRNA TP73-AS1在肝细胞癌细胞系增殖凋亡的功能，评估lncRNA TP73-AS1在肝细胞癌中的表达及其相关性；就lncRNA TP73-AS1对于肝癌及其作用的分子机制进行了初步研究。现报道如下。

1　方法与数据

1.1材料人肝细胞癌细胞系HepG-2由哈尔滨医科大学附属第二医院普外科丁超馈赠，用DMEM高糖(含10%小牛血清)培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养。抗Bcl-2、抗Bax、Bad及p53单克隆抗体(美国Cell Signaling)。

1.2方法

1.2.1MTT法测定HepG-2细胞生长抑制率将1×105/L的HepG-2细胞接种于96孔板中，贴壁培养24 h后，向培养细胞中加入lncRNA TP73-AS1-siRNA，转染48 h。每组设定6个平行孔，并设定空白对照。在吸光度(A570)检测。

1.2.2Caspase-3活性检测将各组细胞收集到离心管中，1 500 r/min、4 ℃离心5 min，收集细胞，弃去上清，PBS 洗涤1次，离心，再次吸尽上清，加入50 μL裂解液，重悬沉淀，混匀，冰裂解15 min。4 ℃、13 500 r/min离心15 min。将上清转移至冰浴预冷的1.5 mL离心管中。立即按Caspase-3活性检测试剂盒说明书测定Caspase-3酶活性，同时取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度。

1.2.3Western blot分析蛋白质的提取PBS漂洗各组细胞2次，4 ℃、5 000 r/min离心10 min。收集细胞，加入裂解液80 μL (RIPA∶蛋白酶抑制剂=1∶100)，冰上超声(60 Hz)打碎，10 min/次，13 500 r/min离心15 min吸上清。BCA法测蛋白浓度。80 μg总蛋白质浓度在8%～10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至NC膜，然后将膜置于5%脱脂奶粉中室温封闭2 h后，PBS冲洗。加入Bcl-2、Bax一抗(1∶1 000)、p53 (1∶500) 4 ℃过夜。用PBS-T缓冲液洗膜3次，15 min/次，然后用红外荧光标记二抗(1∶10 000)对膜室温孵育1 h后，用PBS-T冲洗NC膜3次，10 min/次。利用Odyssey红外荧光扫描成像系统对膜上蛋白进行检测。

1.2.4Real-time PCR所有RNA均来自于肝细胞癌HepG-2细胞，采用Trizol试剂提取总RNA(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，USA)，根据说明书，取约1 μg，用于合成cDNA。通过荧光定量PCR TP73-AS1 lncRNA表达水平(ABI 7500fast系统，应用生物系统，CA，USA)，以GAPDH作为内对照。RT-PCR结果显示，相对于lncRNA TP73-AS1和GAPDH的表达，正向和反向引物序列lncRNA TP73-AS1：5′CCGGTTTTCCAGTTCT TGCAC 3′，5′GCCTCACAGGGAAACTTCATGC 3′；GAPDH：5′TCTACATGTTCCAGTATGACTC 3′，5′ACTCCACGACATACTCAGCACC 3′。

1.3肝癌测序数据来源从TCGA数据库中下载肝癌的外显子数据，整理并建立样本与基因组成的矩阵模式的表达谱，包括250个癌症样本、50个正常样本。计算lncRNA、gene的表达水平。

1.4识别显著共表达lncRNA-gene关系对计算表达谱上任意lncRNA与任意gene表达的皮尔森相关系数(PCC)，随机扰动gene、lncRNA标签100次，重新计算PCC，寻找出显著相关的lncRNA-gene关系对(PCC>0.7且P<0.01)。

1.5从表达谱提取差异表达lncRNA利用R语言程序包EdgeR计算lncRNA的差异表达值，以|log2(FoldChange)|>1且EdgeR的FDR<0.25为阈值，获取差异表达的lncRNA。

1.6识别肝癌相关lncRNA及其下游调控通路将以上差异表达lncRNA映射到网络中，其中度最大的lncRNA被认为是肝癌相关的lncRNA，并进行试验验证。将与此lncRNA共表达的mRNA进行KEGG通路映射，寻找下游潜在通路。

2　结果

2.1lncRNA TP73-AS1在肝细胞癌中高表达构建肝癌相关lncRNA-mRNA共表达网络。其中包含25 439对显著的lncRNA-mRNA关系。共获取305个差异表达lncRNA，将其映射到上述共表达网络中，映射出22个差异的lncRNA，其中TP73-AS1映射度最高，在网络中与62个基因有显著的PCC。将lncRNA的62个互作基因作KEGG pathway map，结果viral carcinogenesis pathway(病毒致癌作用)被映射出来。TP73-AS1潜在调控了下游基因CREBBP，且CREBBP能影响下游p53信号通路(见图1)，因此，高表达的TP73-AS1可能通过调控p53基因起到抑制癌症的作用。

图1　lncRNA TP73-AS1与其潜在调控下游通路

2.2lncRNA TP73-AS1-siRNA对肝细胞癌HepG-2细胞存活率的影响为了验证TP73-AS1是否参与HepG-2凋亡过程，首先通过MTT和AO/EB对其细胞活力及细胞形态进行检测。将TP73-AS1-siRNA转染到HepG-2细胞中，作用48 h后，结果显示，与对照组相比，HepG-2的生长受到抑制(P<0.05)。同时，AO/EB结果显示，HepG-2细胞发生凋亡。见图2。

图2　TP73-AS1-siRNA对HepG-2细胞活性的改变(n=3)

2.3lncRNATP73-AS1-siRNA对于肝细胞癌HepG-2细胞凋亡通路的影响为了进一步验证TP73-AS1是否通过p53诱导HepG-2细胞凋亡，应用Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax，同时检测p53蛋白的变化。结果显示，与Control相比，TP73-AS1-siRNA作用48 h后，HepG-2细胞中Bax蛋白表达显著上调(n=3，P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达显著下调(n=3，P<0.05)，见图3(A)；p53蛋白表达与Control相比明显上调(n=3，P<0.05)，见图3(B)；与Control相比，Caspase-3活性显著增加(n=3，P<0.05)，见图3(C)。

3　讨论

本文利用生物信息学方法来识别肝细胞癌相关的lncRNA，首先通过处理高通量测序数据来识别差异表达的lncRNA。同时构建肝癌相关lncRNA-mRNA共表达网络，并将差异表达的lncRNA映射到该共表达网络中。共有22个差异表达的lncRNA被映射到该网络中，其中度(连接mRNA个数)最多的节点为TP73-AS1。我们认为，该lncRNA为肝癌相关的lncRNA。因为它不仅仅是差异表达的lncRNA，而且潜在的调控对象最多，可能广泛参与了肝癌发生发展过程中的各个通路过程。此外，我们发现TP73-AS1可能调控基因CREBBP，而该基因的下游通路为p53信号通路。

图3　TP73-AS1-siRNA对Bax、Bcl-2 (A)及p53 (B)蛋白的影响，及其Caspase-3活性改变(n=3)

为了验证TP73-AS1是否通过p53信号通路参与了HepG-2细胞的凋亡，本研究检测了Bcl-2、Bax、p53蛋白的变化，以及Caspase-3活性。结果显示，与对照组比较，TP73-AS1-siRNA能够增加Bax/Bcl-2的比值[16]，而加入TP73-AS1-siRNA作用后，检测Caspase-3活性，发现其活性增加。因此，本研究结果表明，TP73-AS1是通过激活Caspase-3，进而激活p53蛋白，参与HepG-2细胞凋亡过程，为lncRNA对于肝细胞癌的治疗提供了理论依据，同时为临床中肝癌的治疗提供了新的方法和思路。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2]Liapi E,Geschwind JF.Transcatheter and ablative therapeutic approaches for solid malignancies[J].J Clin Oncol,2007,25(8):978-986.

[3]Saab S,Zhou K,Chang EK,et al.De novo Hepatocellular carcinoma after liver transplantation[J].J Clin Transl Hepatol,2015,3(4):284-287.

[4]Vilchez V,Turcios L,Marti F,et al Targeting Wnt/beta-catenin pathway in hepatocellular carcinoma treatment[J].World J Gastroenterol,2016,22(2):823-832.

[5]Trevisani F,Cantarini MC,Wands JR,et al.Recent advances in the natural history of hepatocellular carcinoma[J].Carcinogenesis,2008,29(7):1299-1305.

[6]Bruix J,Llovet JM.Major achievements in hepatocellular carcinoma[J].Lancet,2009,373(9664):614-616.

[7]Liu J,Jung C,Xu J,et al.Genome-wide analysis uncovers regulation of long intergenic noncoding RNAs in Arabidopsis[J].Plant Cell,2012,24(11):4333-4345.

[8]Di Gesualdo F,Capaccioli S,Lulli M.A pathophysiological view of the long non-coding RNA world[J].Oncotarget,2014,5(22):10976-10996.

[9]Wang SH,Wu XC,Zhang MD,et al.Long noncoding RNA H19 contributes to gallbladder cancer cell proliferation by modulated miR-194-5p targeting AKT2[J].Tumour Biol,2016 Jan 23.[Epub ahead of print]

[10]Lu X,Zhou C,Li R,et al.Critical role for the long non-coding RNA AFAP1-AS1 in the proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma[J].Tumour Biol,2016 Jan 23.[Epub ahead of print]

[11]Zang W,Wang T,Wang Y,et al.Knockdown of long non-coding RNA TP73-AS1 inhibits cell proliferation and induces apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncotarget,2016 Jan 21.[Epub ahead of print]

[12]Chen WM,Huang MD,Sun DP,et al.Long intergenic non-coding RNA 00152 promotes tumor cell cycle progression by binding to EZH2 and repressing p15 and p21 in gastric cancer[J].Oncotarget,2016,7(9):9773-9787.

[13]Tahira AC,Kubrusly MS,Faria MF,et al.Long noncoding intronic RNAs are differentially expressed in primary and metastatic pancreatic cancer[J].Mol Cancer,2011,10:141.

[14]Yuan J,Yue H,Zhang M,et al.Transcriptional profiling analysis and functional prediction of long noncoding RNAs in cancer[J].Oncotarget,2016,7(7):8131-8142.

[15]Peng JF,Zhuang YY,Huang FT,et al.Noncoding RNAs and pancreatic cancer[J].World J Gastroenterol,2016,22(2):801-814.

[16]Zheng F,He K,Li X,et al.Transient overexpression of TGFBR3 induces apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells[J].Biosci Rep,2013,33(2):e00029.

Effect of long non-coding RNA TP73-AS1 on the cell apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG-2 cells and its mechanism

ZHANG Hui-rui,JIAO Jun-dong*

(Medical Department,The Second Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150080,China)

ObjectiveTo explore the expression profile of long non-coding RNA (lncRNA) TP73-AS1 in hepatocellular carcinoma,and observe the effect and mechanism of lncRNA TP73-AS1 on the apoptosis of cells of hepatocellular carcinoma.MethodsThe RNASEQ data was downloaded and processed from TCGA database,and significant hepatocellular carcinoma-related co-expression network of lncRNA and mRNA was obtained by using biochemical informatics method.The hepatocellular carcinoma-associated lncRNA TP73-AS1 was identified first.The function was evaluated by MTT,AO/EB and Western Blot.ResultsThere were 25 439 pairs of co-expression of lncRNA-gene,and 22 different lncRNAs were mapped,in which TP73-AS1 was the highest,whose interaction gene (n=62) was mapped to viral carcinogenesis pathway and affected the downstream MAPK pathway and p53 pathway.lncRNA TP73-AS1-siRNA affected the proliferation of HepG-2,up-regulated the expression of Bax,increased the activity of Caspase-3,down-regulated the expression of Bcl-2 and increased the expression of p53.ConclusionlncRNA TP73-AS1 regulates the apoptosis of cells of hepatocellular carcinoma,and it may be a novel prognostic biomarker that could serve as a potential therapeutic target in the treatment of hepatocellular carcinoma.

Long non-coding RNA;Co-expression network;Hepatocellular carcinoma;Apoptosis

2016-02-03

哈尔滨医科大学附属第二医院医务科，哈尔滨 150080

10.14053/j.cnki.ppcr.201608002