熊果酸诱导人急性髓系白血病细胞株U937细胞凋亡的实验研究

潘莉萍，袁　伟，郭静明



熊果酸诱导人急性髓系白血病细胞株U937细胞凋亡的实验研究

潘莉萍*，袁伟，郭静明

目的探讨熊果酸对人急性髓系白血病细胞株U937细胞的作用及机制。方法用不同浓度的熊果酸处理对数生长期的U937细胞48 h后，采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测其对细胞增殖的影响；Annexin V/PI染色和流式细胞仪检测细胞凋亡；免疫印迹法(Western blot)检测Wnt、β-catenin、p53、Bcl-2、Bax表达，以及细胞浆凋亡诱导因子(AIF)和细胞色素蛋白C (CytC)蛋白表达。结果熊果酸呈浓度依赖性诱导U937细胞增殖抑制和凋亡，上调Bax和细胞浆AIF、CytC表达，下调Wnt、β-catenin、p53及Bcl-2表达。结论熊果酸对U937白血病细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用，其机制可能为抑制Wnt/β-catenin/p53信号途径促发白血病细胞死亡。

熊果酸；U937；增殖；凋亡；Wnt/β-catenin

0　引言

白血病是好发于儿童和青壮年的造血系统恶性肿瘤，其死亡率居儿童及35岁以下肿瘤死亡人群的首位[1]。近年来，由于白血病的发病率和死亡率升高，研究治疗白血病的药物和方法的需求越发迫切[1-2]。天然植物是抗肿瘤药物的重要来源，熊果酸又名乌苏酸，是从女贞子、白花蛇舌草、夏枯草、乌梅等天然植物中提取的活性成分，其结构为五环三萜类，具有抗菌、抗凋亡等作用，常用于病毒性肝炎等疾病的治疗[3]。最近研究发现，熊果酸具有抗肿瘤活性，但其对白血病的作用及机制尚不明确[3-4]。本研究以人白血病细胞株U937为靶细胞，探讨熊果酸对白血病细胞株U937的作用及机制。

1　材料

1.1药品与试剂熊果酸(Sigma，USA)经HPLC鉴定纯度超过99%；四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖及细胞毒性试剂盒(南京凯基)，Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基，100 μL)，RPMI 1640培养基(GIBCO，USA)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Wnt (CST，USA)，β-catenin (CST，USA)，p53 (CST，USA)。β-actin抗体(Abcam，China)，Bcl-2 (CST，USA)，Bax (CST，USA)，AIF (CST，USA)，CytC(CST，USA)。蛋白裂解液RIPA(碧云天，武汉谷歌)，细胞浆蛋白提取试剂盒(碧云天，武汉谷歌)，蛋白酶抑制剂cocktail、Western blot凝胶制备试剂盒(武汉谷歌)；BCA蛋白定量试剂盒(碧云天，PP1001，100 mL)。

1.2细胞培养人白血病细胞株U937购于中科院细胞库，培养于37 ℃、 5% CO2培养箱中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，生长至占据75%～85%培养瓶面积时，用胰蛋白酶消化传代。

1.3仪器CO2细胞培养箱(Forma scientific，USA)；倒置显微镜和激光共聚焦显微镜(日本，Olympus)；酶标仪(Thermo Fisher，USA)。PVDF膜(Roche，瑞士)，ECL试剂盒(Bi-pech，USA)，胶片及化学发光仪(Kodak，USA)。

1.4MTT 法检测U937细胞增殖取对数生长期U937细胞，按实验分组加入熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，将待测的100 μL细胞悬液加入96孔板中，每孔加入5 g/L MTT液20 μL，继续孵育4 h，加入DMSO 150 μL，振荡溶解10 min。每组做2个复孔。用酶联免疫检测仪测定490 nm波长下的吸光度(A)，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率=(1-A试验/A对照)。

1.5Annexin V/PI 双染检测U937细胞凋亡取对数生长期U937细胞，按实验分组加入熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，将待测的100 μL细胞悬液加入96孔板中。按Annex5/PI染色试剂盒说明书进行操作，细胞收集于75%冰乙醇内，-20 ℃固定2 h以上，收集细胞，2 000 r/min离心5 min，PBS漂洗后每孔加入PI染料150 mL，室温避光孵育30 min后，用流式细胞仪检测凋亡，所有实验重复3次。

1.6Western blot检测蛋白表达收集各浓度组处理的细胞，用预冷的PBS清洗后，按照蛋白裂解液RIPA操作说明提取总蛋白，检测Wnt、β-catenin、p53、Bcl-2及Bax，利用细胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞浆蛋白，检测AIF、CytC，应用BCA法进行蛋白定量。取各组细胞总蛋白和细胞浆蛋白样品100 μg，以样品中的β-actin为内参，经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，然后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭2 h，分别加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释p53 (1∶500)、Wnt (1∶500)、β-catenin (1∶500)、Bax (1∶500)、Bcl-2 (1∶500)、CytC (1∶500)、AIF (1∶500)和β-actin (1∶3 000)抗体，4 ℃孵育过夜。PBS洗膜3次，10 min/次，再与1∶2 000稀释的相应二抗室温反应1 h，充分洗涤后，经化学发光试剂盒检测。

2　结果

2.1熊果酸抑制U937细胞增殖0、10、20、40 μmol/L熊果酸的抑制率分别为0、10%±5%、30%±5%、50%±5%。表明熊果酸>10 μmol/L能明显抑制U937细胞增殖(P<0.05)，且随着熊果酸浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。见图1。

图1　MTT检测熊果酸对U937细胞的抑制作用

2.2熊果酸诱导白血病细胞U937凋亡U937细胞经熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，随着浓度的增加，细胞凋亡比例逐渐增高(见图2)，细胞凋亡率分别为8.4%±2.7%、24.3%±3.7%、36.4%±4.7%、57.6%±5.2%，见图2。

图2　Annexin V/PI双染法检测熊果酸对U937细胞凋亡的影响

2.3熊果酸对凋亡相关蛋白的影响U937细胞经熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，随着浓度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax表达增加(P<0.05)，见图3、表1。

图3　Western blot检测熊果酸对Bcl-2、Bax表达的影响

表1　熊果酸对U937细胞Bcl-2、Bax表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.4熊果酸对促凋亡诱导蛋白的影响U937细胞经熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，随着浓度的增加，细胞浆中促凋亡诱导蛋白AIF、CytC表达增加(P<0.05)。见图4、表2。

图4　Western blot检测熊果酸对细胞浆AIF、CytC表达的影响

表2　熊果酸对U937细胞浆中AIF、CytC表达的影响

注：与对照组比较，**P<0.01

2.5熊果酸对Wnt/β-catenin/p53信号通路的影响U937细胞经熊果酸0、10、20、40 μmol/L作用48 h后，随着浓度的增加，Wnt、β-catenin、p53表达减少(P<0.05)。见图5、表3，提示熊果酸可呈浓度依赖性抑制该信号通路的活化。

图5　Western blot检测熊果酸对Wnt、β-catenin和p53蛋白表达的影响

表3　熊果酸对Wnt、β-catenin和p53蛋白表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3　讨论

近期研究发现，熊果酸对乳腺癌MCF-7、肺癌A549等多种细胞具有明显的毒性杀伤作用[5]，因而作为潜在的抗肿瘤药物而广泛研究。而熊果酸对白血病的作用及机制目前尚不十分明确。

U937为急性髓系白血病细胞株，目前广泛用于急性髓系白血病的研究。我们首先利用MTT检测熊果酸对人急性髓系白血病细胞株U937活性的影响，结果显示，U937细胞对熊果酸的作用极其敏感。表明熊果酸可剂量依赖性地抑制U937增殖，之后利用Annexin V/PI 双染法检测，结果表明，熊果酸可以明显促进人白血病细胞U937凋亡，提示熊果酸作为抗白血病药物具有可行性。为进一步证实熊果酸的抗白血病肿瘤的作用机制，本研究应用Western blot测试熊果酸对Wnt/β-catenin/p53和部分凋亡相关蛋白表达的影响，结果显示，熊果酸可以降低Wnt、β-catenin和p53蛋白的表达，表明熊果酸主要是通过抑制Wnt/β-catenin/p53信号通路影响白血病细胞的增殖和凋亡。白血病细胞的凋亡受到抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白表达的共同调节，正常生理情况下两者呈动态平衡，而平衡一旦破坏，就会出现细胞凋亡或永生化(即癌变)[6]，而抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表达受CytC和凋亡诱导因子(AIF)迁徙的影响，CytC和AIF的迁徙增大表现为细胞浆中AIF和CytC表达增加[7]。结果显示，熊果酸可促进细胞浆CytC和AIF表达，增加促凋亡蛋白Bax的表达，减少抗凋亡蛋白Bcl-2表达，且降低程度与熊果酸浓度呈正相关。结果显示，熊果酸可通过促进CytC和AIF迁徙，上调Bax且下调Bcl-2的表达，进而诱发人白血病细胞的凋亡过程。

综上所述，本研究证实了熊果酸可抑制人白血病细胞生长，促进白血病细胞凋亡，并初步研究了熊果酸抗白血病的生理作用机制，提示其作用机制与抑制Wnt/β-catenin/p53信号途径相关，讨论了熊果酸作为治疗白血病药物的可行性。但肿瘤的产生及进展是一个极其复杂的病理生理过程，抗肿瘤药物的选择依然十分困难，本研究仅从细胞角度探讨了熊果酸对白血病细胞的增殖和凋亡方面的作用，结果提示，Wnt/β-catenin/p53信号通路可能仅是其作用的一个靶点，具体的作用机制仍需进一步研究。

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Study of urosonic acid-induced apoptosis of human acute myeloid leukemia cells U937

PAN Li-ping*,YUAN Wei,GUO Jing-ming

(Department of Hematology,Yichang Central People′s Hospital of the First Clinical Medical College,Three Gorges University,Yichang 443003,China)

ObjectiveTo explore the effects and mechanisms of urosonic acid on human acute myeloid leukemia cells U937.MethodsThe human acute myeloid leukemia U937 cells were treated with different concentrations of urosonic acid for 48 h.The cell growth was examined by MTT assay.Cell apoptosis was determined by Annexin V/PI staining.Moreover,the expression of Wnt,β-catenin,p53,Bcl-2 (apoptosis related protein-2),Bax and the cytoplasm of AIF (apoptosis inducing factor) and cytochrome protein C (CytC) was measured by Western blot.ResultsUrosonic acid could induce the proliferation inhibition and apoptosis of U937 cell,up-regulate the expression of Bax and down-regulate the expression of Bcl-2,Wnt,β-catenin and p53 on U937 cell in a dose-dependent manner.Furthermore,urosonic acid could also increase the expression of AIF and CytC in the cytoplasm.ConclusionUrosonic acid can significantly induce the proliferation inhibition and apoptosis of U937 leukemia cells,the mechanism may be associated with suppressing the activation of Wnt/β-catenin/p53 signaling.

Urosonic acid;U937;Proliferation;Apoptosis;Wnt/β-catenin

2016-02-23

三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院血液科，湖北 宜昌 443003

10.14053/j.cnki.ppcr.201608005