响应面优化丹参饮水提液壳聚糖絮凝纯化工艺

潘美云，邹艳君，李帆帆，林　勉，麻淑磊*



·药学研究·

响应面优化丹参饮水提液壳聚糖絮凝纯化工艺

潘美云1，邹艳君2，李帆帆1，林勉2，麻淑磊2*

目的利用响应面设计法优化壳聚糖絮凝纯化丹参饮水提液工艺。方法在单因素研究的基础上，以液料比、壳聚糖加入量、絮凝温度和絮凝时间为考察因素，以透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率综合评分为评价指标，使用Box-Behnken设计实验方案，借助Design Expert 8.0.6b试验设计软件绘制响应面曲线图，优选最佳絮凝工艺。结果确定最佳絮凝工艺为液料比10.7 mL/g，壳聚糖加入量1.2 mL/g，絮凝温度51 ℃条件下处理1 h。结论响应面法优化壳聚糖絮凝纯化工艺稳定可行，除杂率高，有效成分损失量少。

丹参饮；响应面；壳聚糖；絮凝纯化

0　引言

丹参饮出自《时方歌括》，由丹参、檀香、砂仁3味药组成。其中丹参为君，化瘀止痛而不伤气血；檀香、砂仁为臣药，檀香辛温调气、和胃通络，砂仁行气调胃解郁，三药合用，共奏活血行滞、解郁镇痛之功。丹参饮在临床上应用广泛，可治疗多种病症，广泛用于冠心病[1-2]、慢性胃炎[3-4]、消化性溃疡[5-8]、心血管疾病[9]、肾功能衰竭[10]等的治疗。

2009年四川省药品食品监督管理局制定的《四川省医疗机构制剂研究技术要求》中古代经典名方目录(第一批)已将丹参饮收录其中，蒲清荣等[11]通过薄层鉴别法、紫外-可见分光光度法测定丹参饮口服液，并初步建立其质控标准。

口服液的制备中，对水提液的纯化除杂比较困难。本研究选择壳聚糖为絮凝剂，首先对药液的液料比、壳聚糖加入量、絮凝温度和絮凝时间进行单因素考察，再用响应面法优化筛选各因素，并以透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率的综合评分为评价指标。方中丹参为君药，丹酚酸B是其主要的活性成分，本研究将其作为含量分析的指标，权重系数为40%；透光率反映絮凝纯化的程度，权重系数为30%；固含物整体反映药液中物质成分的比重，权重系数为30%。综合得分=(透光率/最大透光率)×100×30%+(固含物保留率/最大固含物保留率)×100×30%+(丹酚酸B保留率/最大丹酚酸B保留率)×100×40%。

1　仪器和试药

高效液相色谱仪DIONEX U3000 (美国赛默飞世尔科技有限公司)，超纯水仪Synergy UV system (法国millipore)，智能溶出仪 RC806(天津天大天发科技有限公司)，旋转蒸发仪 RV10(上海人和仪器有限公司)，电子分析天平 XS-105[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]，电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9240A(上海一恒科技有限公司)，恒温混匀仪MS-100(上海净信实业发展有限公司)，数控超声波清洗器 KQ-500DB，高速台式离心机 TDZ5-MS(湖南湘仪实验仪器有限公司)，数显电子恒温水浴锅 DK-98-IIA(天津泰斯特仪器有限公司)。

丹参(产地：四川，批号：140301)，砂仁(产地：广东，批号：140501)，檀香(产地：云南，批号：140501)购自温州市华宇中药饮片有限公司。丹酚酸B对照品(批号：11562-201009，含量：93.7%)购自中国食品药品检定研究院；壳聚糖(浙江宁波华泰化工有限公司)；冰醋酸、甲醇、无水乙醇、磷酸为分析纯；乙腈为色谱纯。

2　方法与结果

2.1丹参饮水提液的制备采用《医宗金鉴》的药物配比，即丹参30 g、砂仁3 g、檀香3 g。取丹参300 g、砂仁30 g、檀香30 g加水3 000 mL浸泡1 h，于60 ℃减压提取1 h，真空度0.07 MPa，提取2次，抽滤得提取液。

2.2壳聚糖溶液的制备取壳聚糖2 g，加入1%醋酸溶液100 mL，60 ℃水浴中搅拌均匀，使其溶解，配制成2%的壳聚糖溶液。

2.3絮凝过程取上述丹参饮水提液200 mL于智能溶出仪中，加入一定量2%壳聚糖溶液，搅拌使其混合均匀，设定温度，于智能溶出仪中进行反应，结束后，离心取上清液。

2.4透光率测定取絮凝后的上清液适量，以蒸馏水为参比，在日本岛津UV-2450型紫外分光光度计上对丹参饮水提液进行全波段扫描，波长范围为200～800 nm，重复3次，取平均值，得284 nm处为最佳吸收波长。见图1。在284 nm处测定吸光度，换算为透光率。换算公式：A=-lgT，其中A为吸光度，T为透光率。

图1　丹参饮最大吸光度

2.5HPLC法测定丹酚酸B含量[12]

2.5.1色谱条件Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液(22∶78)为流动相，检测波长为286 nm，柱温：20 ℃，流速：1.2 mL/min，进样量10 μL。该色谱条件下，丹酚酸B得到很好的分离，结果见图2。

2.5.2对照品溶液的制备精密称取丹酚酸B对照品6.36 mg置于20 mL容量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，制成储备液。根据下述实验要求，将对照品溶液稀释，浓度分别为114.0、68.4、34.2、17.1、13.7 μg/mL。2.5.3供试品溶液的制备称取丹参饮干浸膏约0.1 g置于50 mL容量瓶，加80%甲醇至刻度，称定重量，超声处理(功率140 W，频率42 kHz) 30 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图2　丹酚酸B及丹参样品色谱图

2.5.4线性关系考察分别精密吸取11.92、14.90、29.80、59.59、148.98 μg/mL的丹酚酸B对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测得峰面积积分值。以峰面积积分值为纵坐标、丹酚酸B对照品进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=47.901 X-0.211 44 (R2=0.999 3)，结果显示，丹酚酸B在0.119～1.490 μg内呈现良好的线性关系，符合实验要求。

2.5.5精密度考察取浓度为29.80 μg/mL的丹酚酸B对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，得RSD为0.51%(n=6)，表明精密度良好，符合实验要求。

2.5.6加样回收试验称取已知含量的丹参饮干浸膏样品0.1 g于50 mL量瓶中，共6份，加入丹酚酸B对照品适量，按上述供试品制备方法及色谱条件制样、测定，计算丹酚酸B平均回收率为97.1%，RSD为1.63%，结果表明，准确度符合实验要求。

2.5.7稳定性考察取丹参饮供试品溶液，分别于0、5、10、15、20、25、30 h进样，测定丹酚酸B峰面积值，得RSD为1.25%，表明供试品溶液丹酚酸B在30 h内稳定。

2.5.8重复性考察称取已知含量丹参饮干浸膏样品0.1 g于50 mL量瓶中，共6份，按上述供试品溶液制备方法进行制备，精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，进行含量测定分析，得丹酚酸B含量平均值为1.53 mg/mL，RSD值为1.25%，重复性符合实验要求。

2.6絮凝工艺单因素试验优选丹参饮水提液絮凝工艺的条件，进行药液的液料比、壳聚糖加入量、絮凝温度、絮凝时间单因素试验，确定响应面优化试验各因素的水平。

2.6.1丹参饮水提液液料比对絮凝工艺的影响按“2.1.2”项下方法制备丹参饮水提液，减压浓缩至水提液液料比为6、8、10、12、14 mL/g，按1.0 mL/g (壳聚糖溶液/生药)比例分别加入壳聚糖溶液，于50 ℃条件下，搅拌处理1 h，静置2 h，5 000 r/min离心20 min，取上清液。测定透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率，并结合权重系数计算综合评分，各指标结果见图3。

由图3可见，絮凝液透光率在液料比为6 mL/g时最小，随着液料比的改变，在液料比为10 mL/g时，絮凝液透光率最大，但随着液料比的继续改变，透光率又稍微减小。而固含物保留率在液料比为6 mL/g时最大，随着液料比的改变，由于单位体积药液与壳聚糖结合率逐渐增大，固含物保留率逐渐变小；丹酚酸B保留率随着液料比的变化，在8 mL/g时最大，但并无显著变化。在液料比为10 mL/g时，综合评分最高，故选择液料比为絮凝工艺的影响因素，水平分别为8、10、12 mL/g。

图3　液料比对絮凝工艺的影响

2.6.2壳聚糖加入量对絮凝工艺的影响取液料比为10 mL/g的丹参饮水提液，分别加入比例为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/g(壳聚糖溶液/生药)的2%壳聚糖溶液，于50 ℃条件下，搅拌处理1 h，静置2 h，5 000 r/min离心20 min，取上清液。测定透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率，并结合权重系数计算综合评分，见图4。

图4　壳聚糖加入量对絮凝工艺的影响

由图4可见，在加入0.5 mL/g(壳聚糖溶液/生药)2%壳聚糖溶液时，加入壳聚糖未能充分絮凝纯化药液，絮凝液透光率最小；随着壳聚糖加入量的增加，透光率逐渐增大，在加入量为0.5 mL/g时透光率最大；然而随着壳聚糖加入量继续增加，透光率又慢慢变小，这可能因为药液中过多的壳聚糖残留减低了药液的透光率。固含物保留率在壳聚糖加入量为0.5 mL/g时最大，随着壳聚糖加入量的慢慢增加，药液中杂质充分与壳聚糖结合产生絮状物质，固含物保留率逐渐减小。而丹酚酸B保留率在壳聚糖加入量逐渐增加的过程中先增大后减小。在壳聚糖加入量为1.0 mL/g时，综合评分最高，故选择壳聚糖加入量为絮凝工艺的影响因素，水平分别为0.5、1.0、1.5 mL/g。

2.6.3絮凝温度对絮凝工艺的影响取液料比为10 mL/g的丹参饮水提液，加入比例为1.0 mL/g(壳聚糖溶液/生药)的2%壳聚糖溶液，分别于30、40、50、60、70 ℃条件下处理1 h，搅拌处理1 h，静置2 h，5 000 r/min离心20 min，取上清液。测定透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率，并结合权重系数计算综合评分，见图5。

图5　絮凝温度对絮凝工艺的影响

由图5可见，絮凝液透光率在絮凝温度为30 ℃时，絮凝液透光率最小，原因是在30 ℃时，壳聚糖与药液未能充分反应，药液未充分絮凝纯化。随着絮凝温度逐渐升高，透光率逐渐提高，在絮凝温度为50 ℃时透光率最高；随着絮凝温度的继续升高，透光率降低，原因是随着温度不断升高，导致絮凝作用过快，絮状沉淀细小或无法沉降，故透光率有所下降。固含物保留率在絮凝温度为30 ℃时最高，可能是因为此时发生了充分絮凝纯化作用，壳聚糖也残留其中，固含物含量增加，同时，导致此温度下丹酚酸B保留率较低。随着温度逐渐升高，药液中杂质与壳聚糖充分结合，产生絮状物质，固含物保留率逐渐降低。随着壳聚糖加入量的逐渐增加，丹酚酸B保留率先增大后减小，在长时间的高温处理下，丹酚酸B发生降解，故在70 ℃时，丹酚酸B保留率最低。在絮凝温度为50 ℃时，综合评分最高，故选择絮凝温度为絮凝工艺的影响因素，水平分别为40、50、60 ℃。

2.6.4絮凝时间对絮凝工艺的影响取液料比为10 mL/g的丹参饮水提液，加入比例为1.0 mL/g (壳聚糖溶液/生药)的2%壳聚糖溶液，于50 ℃下处理0.5、1、1.5、2、2.5 h，分别测定透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率，结果见图6。

由图6可见，絮凝时间为0.5 h时，透光率最小，固含物保留率和丹酚酸B保留率最大。随着絮凝时间的延长，透光率和丹酚酸B保留率略有增大，之后无显著变化。综合评分在絮凝时间为1 h时达到最大值。故絮凝时间在絮凝纯化工艺中为非显著性影响因素，对絮凝纯化工艺试验的絮凝时间为1 h。

图6　絮凝时间对絮凝工艺的影响

2.7响应面优化试验设计、方案及结果分析

2.7.1响应面优化试验设计单因素考察结果表明，丹参饮水提液液料比、壳聚糖加入量和絮凝温度是影响絮凝纯化工艺较大的3个因素，故选择液料比(X1)、壳聚糖加入量(X2)和絮凝温度(X3)为自变量，以透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率的综合评分为响应值，设计3因素3水平共17个试验点的响应面分析试验。星点设计实验因素、水平见表1。

表1　响应曲面因素与水平

2.7.2响应曲面法试验方案及结果分析按照BBD的试验方案进行3因素3水平共17个试验点的响应面分析试验，结果见表2。

表2　Box-Behnken试验设计以及响应值

注：综合得分=(透光率/最大透光率)×100×30%+(固含物保留率/最大固含物保留率)×100×30%+(丹酚酸B保留率/最大丹酚酸B保留率)×100×40%。

应用Design-Expert 8.0.6b软件对表3数据进行二次多元回归拟合，得到透光率、固含物保留率、丹酚酸B保留率的综合评分(Y)预测值对自变量液料比(X1)、壳聚糖加入量(X2)和絮凝温度(X3)的二次多项回归方程：Y=95.766+1.016 25 X1+1.963 75 X2+0.775 X3+0.985 X1X2-0.312 5 X1X3+0.697 5 X2X3-1.895 5 X12-3.090 5 X22-3.393 X32(R2=0.982 8)。对上述回归模型进行方差分析。见表3。

采用ANOVA分析效应面的回归参数。由表3可知模型是极显著的(P<0.000 1)，回归模型决定系数为0.982 8，说明该模型能够解释98.28%的变化，因此，可用此模型对壳聚糖絮凝纯化工艺进行分析和预测。由表3中的各个P值可见，壳聚糖加入量(X1)、壳聚糖加入量二次项和絮凝温度二次项有极显著性差异(P<0.000 1)，液料比(X1)及其二次项(X12)也具有显著性差异(P<0.005)，说明3个因素对壳聚糖絮凝纯化工艺都有一定的影响。

表3　Box-Behnken试验结果分析

2.8壳聚糖絮凝纯化工艺的响应面优化利用Design Expert 8.0.6b软件对表3数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的等高线及其响应曲面见图7～图9。

图7　液料比和壳聚糖加入量交互作用的响应面等高线和响应面立体图

图8　液料比和絮凝温度交互作用的响应面等高线和响应面立体图

根据二次多项式模型，绘制各考察指标综合得分与各自变量间的等高线图及三维效应面图。据Box-Behnken设计模型分析得知，壳聚糖絮凝纯化工艺的参数：液料比为10.72 mL/g，壳聚糖加入量为1.2 mL/g，絮凝温度51.38 ℃，此时效应值综合评分预测值96.38%。考虑到实际生产情况，调整各因素条件，确定最佳的絮凝纯化工艺条件：液料比10.7 mL/g，壳聚糖加入量1.2 mL/g，絮凝温度51 ℃。

2.9最佳工艺验证为验证该模型的可靠性，根据实际操作，将絮凝纯化工艺参数修正为液料比10.7 mL/g，壳聚糖加入量1.2 mL/g，絮凝温度51 ℃，絮凝1 h。按优选的工艺进行5次验证试验，各批次透光率平均值为74.02%、RSD值为3.85% (≤5.00%)，平均固含物保留率为80.17%、RSD为4.48% (≤5.00%)，平均丹酚酸B保留率81.02%、RSD为3.94% (≤5.00%)，说明优化所得的絮凝纯化工艺稳定、可行。

3　讨论

中药水提及其纯化除杂是各种剂型制备的前提。水提液壳聚糖絮凝纯化法能使药液中的蛋白质、胶体、鞣质等微粒有效絮凝沉降，实现分离纯化的目的。壳聚糖作为絮凝剂，具有安全、无毒、稳定的优点，可用于中药有效成分的分离纯化过程。

本研究在单因素试验的基础上，合理筛选出药液的液料比、壳聚糖加入量、絮凝温度和絮凝时间4个因素的水平，并利用Design-Expert 8.0.6b 软件设计试验，以透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率综合评分为评价指标，对液料比、壳聚糖加入量和絮凝温度进行优化筛选，得最佳的絮凝纯化工艺条件：液料比10.7 mL/g，壳聚糖加入量1.2 mL/g，絮凝温度51 ℃。

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Optimization of flocculation technology of water-extraction solution from Danshen Yin with chitosan by response surface method

PAN Mei-yun1,ZOU Yan-jun2,LI Fan-fan1,LIN Mian2,MA Shu-lei2*

(1.The First People′s Hospital of Wenling,Wenling 317500,China;2.Yongjia Hospital of TCM,Yongjia 325401,China)

ObjectiveTo optimize the flocculation technology of water-extraction solution from Danshen Yin with chitosan by response surface methodology.MethodsThe response surface model was designed by Design Expert 8.0.6b program,and the best formulation was optimized on the basis of single factor analysis,with solid-liquid ratio,chitosan amount,flocculation temperature and flocculation time as the detecting factors,and the light transmission,solid content and salvianolic acid B retention rates as the evaluating indicators.ResultsThe best flocculation conditions were as follows:solid-liquid ratio was 10.7 mL/g with chitosan amount of 1.2 mL/g,and the temperature and time of flocculation was 51 ℃ and 1 h.ConclusionThe flocculation clarification technology optimized by response surface method is feasible and stable with high rate of impurity removal and high retention rate of active ingredient.

Danshen Yin;Response surface;Chitosan;Flocculation

2016-01-03

1.温岭市第一人民医院，浙江 温岭 317500；2.永嘉县中医医院，浙江 永嘉 325401

永嘉县科技发展计划项目(2015306)

10.14053/j.cnki.ppcr.201608022