核壳型色谱柱反相高效液相色谱蒸发光散射检测法同时测定饮料中5种人工合成甜味剂

杨小玉,王玉红,王　彦,万青云,刘元元,薛　芸,李　静,阎　超,,*

(1.上海交通大学药学院,上海 200240;2.上海通微分析技术有限公司,上海 201203)



杨小玉1,王玉红2,王彦1,万青云1,刘元元1,薛芸1,李静2,阎超1,2,*

(1.上海交通大学药学院,上海 200240;2.上海通微分析技术有限公司,上海 201203)

建立了一种同时测定饮料中主要限用人工合成甜味剂:安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖和阿斯巴甜的反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法。采用核壳型HALO色谱柱,甲醇/甲酸-三乙胺缓冲溶液(pH=4.5)为流动相,梯度洗脱,ELSD检测,结果表明5种甜味剂在4.5 min内能够实现完全分离。线性范围为5 μg/mL～500 μg/mL,线性相关性系数大于0.997,方法最低检出限为2 μg/mL,定量限为5 μg/mL。在3个添加水平下,样品的加标回收率为83.0%～106.7%,相对标准偏差为0.84%～3.37%。该方法方便、快速、适用性强并可快速推广,可实现饮料中多种人工合成甜味剂的同时分离检测,同时也适用于无紫外吸收的甜味剂的检测。

反相高效液相色谱,蒸发光散射检测器,核壳型色谱柱,人工合成甜味剂

甜味剂(sweeteners)是一类赋予食品甜味的重要食品添加剂[1],按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。由于人工合成甜味剂的甜度是蔗糖的几十倍至几千倍,在人体内不被代谢吸收、不提供热量,对肥胖、高血压、糖尿病、龋齿等患者有益,加之又具有高效、经济等优点,在食品特别是饮料行业被广泛应用。在我国,允许使用的人工合成甜味剂主要有:安赛蜜,阿斯巴甜,糖精(及钠、钾、钙盐),三氯蔗糖,阿力甜,甜蜜素和纽甜等。然而,近年来甜味剂的滥用现象层出不穷[2],如超种类、超范围、超限量地使用甜味剂。据统计,我国食品中添加的人工合成甜味剂使用量过大,发达国家人工合成添加剂在整个添加剂中占3%～5%的比例,而我国使用人工合成甜味剂的比例则超过了40%。同时研究也已表明人体摄入过多的人工合成甜味剂弊大于利,并且为了改善口感,提高甜味剂的稳定性,人工合成甜味剂大多数情况下都以多种成分复配添加,而非单一使用,而现有的国家标准测定组分单一[3-6],应用面狭窄,所以有必要建立一种能够同时检测多种人工合成甜味剂的分析方法[7-10]。

目前,人工合成甜味剂的测定方法主要有分光光度法、气相色谱法、毛细管电泳[11-12]、离子色谱法[13]和高效液相色谱法[14-15]等,其中反相高效液相色谱法是应用最广的分析检测方法;又因为某些人工合成甜味剂(如甜蜜素,三氯蔗糖)没有紫外吸收,选择通用型检测器[16-17]则成为必然。

核壳型填料色谱柱是一种新型色谱柱,运用创新性熔融核技术制备,其优点为超高柱效、高流速下低谱带展宽、相对较低的反压、出众的耐用性和稳定性等,该色谱柱可在48 s内实现6种苯甲酸类物质(尿嘧啶,邻苯二甲酸,2-氟苯甲酸,3-硝基苯甲酸,3-氟苯甲酸,间甲苯酸)的分离。整体考虑检测成本以及方法的普及,本研究采用HALO-RP-HPLC-ELSD[18]方法,主要针对饮料中的安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖和阿斯巴甜5种人工合成甜味剂的同时分离测定进行了系统研究,最终实现了5种人工合成甜味剂在4.5 min内完全分离,得到了令人满意的定性定量结果。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

碳酸型饮料,茶饮料,功能性饮料以及果汁调和类饮料等超市购买;98%安赛蜜阿拉丁试剂有限公司;99%甜蜜素阿拉丁试剂有限公司;98%阿斯巴甜阿拉丁试剂有限公司;98%三氯蔗糖阿拉丁试剂有限公司;98%糖精钠TCI。

EasySep TM-1020高效液相色谱仪上海通微分析技术有限公司;UM-5000蒸发光散射检测器上海通微分析技术有限公司;KQ2200B型超声波清洗器昆山超声仪器有限公司;FA1004电子天平上海恒平科学仪器有限公司;离心机上海安亭科学仪器厂;氮吹仪上海安谱科学仪器有限公司;固相萃取装置上海安谱科学仪器有限公司;色谱柱:HALO-C18,4.6 mm×150 mm,2.7 μm美国Advanced Materials Technology,ATM公司。

1.2缓冲液与标准溶液的配制

甲酸-三乙胺缓冲液(pH=4.5)的配制:准确量取500 mL纯水置于溶剂瓶中,依次加入0.4 mL甲酸和1.25 mL三乙胺,超声待用。标准储备液的配制:分别准确称取5种人工合成甜味剂0.2 g,置于同一100 mL容量瓶中,用缓冲溶液溶解并定容,经0.22 μm滤膜过滤后,置于冰箱保存备用。标准工作溶液的配制:用pH为4.5的甲酸-三乙胺缓冲溶液将上述标准储备液逐级稀释为2、5、10、20、50、100、150、200、300、400、500 μg/mL的系列标准溶液,置于冰箱保存备用。

1.3样品前处理

碳酸型饮料,茶饮料,功能性饮料以及果汁调和类饮料是人工合成甜味剂的主要添加对象。对于实际样品的前处理方法,也以上述类型的饮料样品为目标,参考相关的国标方法建立。

准确量取样品溶液2 mL于5 mL离心管中,于超声波清洗器中震荡脱气后,加入等量的水,超声提取1 h;将提取液置于离心机中离心5 min,取上清液经过SPE固相萃取C18小柱,首先以4 mL缓冲溶液清洗2次,再以2 mL甲醇洗脱;收集甲醇洗脱液在氮吹仪上进行常温吹干浓缩;加入1 mL缓冲溶液溶解,经0.22 μm滤膜过滤后,加水定容至2 mL作为HPLC待测样品溶液[18]。

2　结果与分析

2.1HPLC分析条件确定

2.1.1流动相体系的确定实验中考察了甲醇/水、甲醇/缓冲液和乙腈/缓冲液不同流动相体系下对5种人工合成甜味剂的分离影响。结果表明,使用缓冲溶液可明显增加样品的分离度并改善色谱峰形;而甲醇/缓冲液和乙腈/缓冲液对比来说,甲醇/缓冲液条件下的信噪比最高,而乙腈的洗脱能力较强,系统压力较低,分离速度更快,但其中安赛蜜的保留时间非常接近死时间,考虑实际样品中可能存在的杂质干扰,本研究中首选甲醇/缓冲液体系作为流动相。

图1　5种甜味剂标准溶液的HPLC-ELSD 图谱 Fig.1　HPLC-ELSD chromatograms of five sweeteners注:(1)安赛蜜;(2)糖精钠;(3)甜蜜素; (4)三氯蔗糖;(5)阿斯巴甜； 条件:色谱柱:HALO-C18,4.6 mm×150 mm,2.7 μm; 流速:0.5 mL/min;载气流量:3.5 L/min;蒸发温度:40 ℃。

2.1.2pH对分离结果的影响实验中考察了缓冲溶液pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5时对5种人工合成甜味剂的分离影响。结果表明,pH变化对样品保留性质有较为明显的影响,各样品的保留时间随着pH的增大而变小,其中pH=3.0时,安赛蜜和糖精钠,三氯蔗糖和阿斯巴甜色谱峰重叠无法分开,pH大于4.0时,5种甜味剂都可实现完全分离,保留时间的差别不大,考虑到阿斯巴甜在pH=4.3左右时稳定性最好,因此,本研究选择缓冲溶液的最佳pH为4.5。

图2　流动相pH对各物质分离的影响Fig.2　Effect of pH on the separation of five sweeteners

2.2检测器的选择

蒸发光散射检测器(Evaporative light-scattering detector,ELSD),是一种自上世纪九十年代开始得到广泛应用的通用型高效液相色谱质量检测器,其原理是首先将色谱柱洗脱液雾化形成气溶胶,然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发,最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测。

蒸发光散射检测器不仅可弥补常规紫外检测(UVD)不能检测无紫外吸收或只有紫外末端吸收物质的缺陷,而且与同样可用于无紫外吸收物质检测的示差折光检测(RID)相比,灵敏度略高、受温度等实验条件影响小和可用于梯度洗脱等优点,近年来受到越来越多的分析工作者的重视,已广泛应用于医药、化工、食品等行业。所要检测的五种甜味剂中,甜蜜素和三氯蔗糖没有紫外吸收,而蒸发光散射检测器(ELSD)作为一种通用的检测器,可以不受物质本身结构的限制,可以适用于任何挥发性弱于流动相的物质的检测。因此,可以满足同时检测五种甜味剂的需求。

2.2.1 ELSD检测条件的选择

2.2.1.1蒸发温度的确定保持载气流速3.0 L/min,以0.1 mg/mL混合标准品溶液的信噪比(S/N)为对象考察ELSD的最佳蒸发温度。结果表明,蒸发温度在40 ℃时信噪比最高。值得注意的是,超过40 ℃时阿斯巴甜的信噪比显著下降,可能是其在高温下不稳定所致。因此,本研究选择最佳蒸发温度为40 ℃。

图3　甜味剂信噪比随蒸发温度的变化Fig.3　The relationship between evaporation temperature and signal-to-noise ratio of sweeteners

2.2.1.2载气流速的确定保持蒸发温度40 ℃,以0.1 mg/mL混合标准品溶液的信噪比(S/N)为对象考察ELSD的最佳载气流速。结果表明,样品信噪比随着载气流速的增加而增大,这种趋势在载气流速到达3.5 L/min后趋于平缓,而基线噪声则略有增大。为了保证样品气溶胶蒸发完全,降低基线噪声的干扰,本研究选择最佳载气流速为3.5 L/min。

图4　甜味剂信噪比随载气流速的变化Fig.4　The relationship between flow rate of Carrier gas and signal-to-noise ratio of sweeteners

2.3色谱柱的选择

国标中采用了普通C18柱,每种方法只能分离一种或两种甜味剂,且需要复杂的梯度条件,出峰时间较长。Wasik,A[18]采用普通C18柱需要12 min才能完全分离5种甜味剂。刘芳[19]采用TOSOH TSK gel ODS-100V色谱柱(15 cm×4.6 mm,3 μm),需要9 min才能完全分离5种甜味剂,并且柱压较高。故采用常规的C18柱,难于同时实现5种样品的快速分离。运用创新性熔融核技术制备而成的新型HALO色谱柱,采用由1.7 μm的无孔核和0.5 μm的多孔壳组成的2.7 μm粒径的硅胶微球,多孔壳层通过提供较短的传质路径以减少了轴向扩散,而实心核则通过提供坚固的支撑结构,以承受高压。该色谱柱拥有更强的分离能力和超快速的分离性能,可以有效提高柱效,同时不显著升高柱压,适用于化合物的快速分离。经过色谱条件的优化,可以在4.5 min内实现五种甜味剂的完全分离。

色谱条件为:色谱柱:HALO-C18,4.6 mm×150 mm,2.7 μm;流动相A:甲酸-三乙胺缓冲液(pH=4.5),流动相B:甲醇,梯度洗脱程序:0～ 1 min,甲醇维持在33%;1.1 min,甲醇从33%变为100%;1.1 ～ 8 min,甲醇维持在100%;流速:0.7 mL/min;蒸发温度:40 ℃;载气类型:空气;载气流速:3.5 L/min;载气压力:433 kPa;进样浓度:0.1 mg/mL;进样量:20 μL。

在此最优条件下得到的色谱分离图如图5所示。

表1　5种甜味剂的线性方程、线性相关系数、线性范围、检出限和定量限Table 1　Regression equation,correlation coefficients(r),linear ranges,limits of detection(LOD,S/N=3)and limits of quantitation(LOQ,S/N=10)of the five sweeteners

图5　5种人工合成甜味剂标准品的HPLC-ELSD色谱图Fig.5　HPLC-ELSD chromatogram of five sweeteners

因考虑要进行实际样品的测定,为防止安赛蜜的色谱峰与实际样品中的杂质峰重合,故适当延长了甜味剂的出峰时间至9 min,以保证不受实际样品杂质的干扰。经过一系列方法优化,最终确定的色谱条件为:色谱柱:HALO-C18,4.6 mm×150 mm,2.7 μm;流动相A:甲酸-三乙胺缓冲液(pH=4.5),流动相B:甲醇,梯度洗脱程序:0 ～ 3 min,甲醇维持在10%,3 ～ 6 min,甲醇从30%变为45%;流速:0.5 mL/min;蒸发温度:40 ℃;载气类型:空气;载气流速:3.5 L/min;载气压力:433 kPa;进样浓度:1 mg/mL进样量:20 μL。

在此最优条件下得到的色谱分离图如图6所示。

图6　5种人工合成甜味剂标准品的HPLC-ELSD色谱图Fig.6　HPLC-ELSD chromatogram of five sweeteners

2.4分析方法学验证

2.4.1线性范围及检出限对1.2节中的系列标准溶液加入空白样品中进行测定,以各甜味剂的质量浓度对数与对应色谱峰的面积对数进行线性回归,以信噪比S/N=3计检出限,S/N=10计定量限,在5～500 μg/mL的范围内5种甜味剂都具有良好的线性关系,相关性系数大于0.997。结果见表1。

目前相关人工合成甜味剂的国家标准[3-6]中,安赛蜜、糖精钠、三氯蔗糖和阿斯巴甜均为单一的HPLC法,其中安赛蜜和甜蜜素的检出限为4.0 μg/mL,三氯蔗糖的检出限为4.0 μg/mL,阿斯巴甜的检出限为2.0 μg/mL。所以,本研究建立的分析方法符合相应国家标准对甜味剂的最低检出限要求,且可同时分离检测5种甜味剂样品,大大提高了工作效率,节省了检测成本。

2.4.2回收率以2.3节最终确定的色谱条件,对实际饮料样品1进行3个水平的加标回收实验(n=3)。从表2可以看出,该方法回收率在83.0%～106.7%之间,3次平行测试的相对标准偏差为0.84%～3.37%,表明本分析方法具有良好的准确性和重复性。

表2　样品1中5种甜味剂的加标量、 添加回收率及其相对标准偏差(n=3)Table 2　Recoveries and relative standard deviations(RSD3)of 5 sweeteners in different samples(n=3)

2.4.3精密度按照2.3节的色谱条件,以0.1 mg/mL混合标准品溶液连续进样6次,6次测定的峰面积相对标准偏差(RSD)为1.90%～3.50%,保留时间RSD为0.06%～0.09%,说明本方法具有良好精密度。

2.5实际样品分析

表3　三种方法对比情况Table 3　The comparition of three methods

运用本文所建立的分析方法,分别对市售的常见碳酸型饮料,茶饮料进行分离检测。其中样品1(碳酸型饮料)产品标注添加:安赛蜜,三氯蔗糖和阿斯巴甜;样品2(茶饮料)产品标注添加:三氯蔗糖,分析结果如下。图7为样品1、样品2的HPLC-ELSD色谱图。

图7　样品1和2的HPLC-ELSD 色谱图Fig.7　HPLC-ELSD chromatograms of Sample 1 and 2注:(1)安赛蜜;(2)甜蜜素;(3)三氯蔗糖;(4)阿斯巴甜。

结果表明,将本方法应用于实际样品分析,均准确的检出产品所标注添加的人工合成甜味剂,其中样品1还额外检出了甜蜜素,样品2还额外检出了安赛蜜,甜蜜素,阿斯巴甜。其中样品1含有的甜味剂量分别为:安赛蜜为123.03 μg/mL,甜蜜素为102.33 μg/mL,三氯蔗糖为93.33 μg/mL,阿斯巴甜为199.53 μg/mL;样品2含有的甜味剂量分别为:安赛蜜为46.09 μg/mL,甜蜜素为16.59 μg/mL,三氯蔗糖为120.23 μg/mL,阿斯巴甜为15.17 μg/mL,本方法表明该两种产品均不符合国家标准。从实际应用角度着眼,本分析方法目标针对性强,方便简便可靠,具有很大的推广价值。

2.6同现有方法对比情况

该方法使用蒸发光散射检测器进行样品检测,可同时快速检测多种无紫外吸收或紫外吸收较弱的甜味剂,且都能满足或超过国标的最低检测限要求,为实际操作过程带来了很大方便。目前已有多篇文章报道甜味剂的分离研究,该方法同现有具有代表性方法进行对比,表现出一些优势,如表3所示。

3　结论

本文建立了人工合成甜味剂糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、安赛蜜和三氯蔗糖的多组分同时检测的HALO-HPLC-ELSD方法。该方法基于国产高效液相色谱-蒸发光散射检测器平台,使用核壳型色谱柱,并配套相应的样品前处理方法,能够在较短的时间内实现五种甜味剂的完全分离,方法简便、快速、灵敏度高,主要针对碳酸型饮料和茶饮料,可以利用该方法开展后续实验,配合适宜的前处理方法,对功能性饮料,果汁调和类饮料等进行检测。相比目前国家标准单一甜味剂的检测方法,本方法大大降低了工作量,易于进行大规模推广,为饮料中多种人工合成甜味剂的检测提供了一种快速且行之有效的方法,同时也为食品安全监督管理提供了有力的帮助。

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Simultaneous determination of five intense sweeteners in beverages by core-shell column-HPLC-ELSD

YANG Xiao-yu1,WANG Yu-hong2,WANG Yan1,WAN Qing-yun1,LIU Yuan-yuan1,XUE Yun1,LI Jing2,YAN Chao1,2,*

(1.School of Pharmacy,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China;2.Unimicro(Shanghai)Technologies Co.,Ltd.,Shanghai 201203,China)

An analytical method has been established to detect 5 intense sweeteners(Acesulfame-k,Sodium saccharin,Cyclamate,Sucralose,and Aspartame)simultaneously in beverages by reverse phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC). The separation process was carried out on a HALO column with methanol/formic acid—triethylamine buffer solution(pH=4.5)as mobile phase with gradient elution. The quanlification and quantitation were accomplished by the evaporative light scattering detector. The 5 sweeteners were baseline separated in 4.5 minutes. The linear range was from 5 μg/mL to 500 μg/mL,with correlation coefficient greater than 0.997. The LOD was 2 μg/mL and LOQ was 5 μg/mL. An average recovery was between 83.0% to 106.7% and the RSD was 0.84%～ 3.37%. The results indicated that the method was simple,quick,serviceable and applicable to detection of sweeteners in beverage,it was also suitable for the detection of no ultraviolet absorption of sweeteners.

reverse phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC);evaporative light scattering detection(ELSD);core-shell column(HALO);sweeteners

2015-07-15

杨小玉(1989-)，女，硕士，研究方向：食品安全，E-mail:13651656949@163.com。

阎超(1956-)，男，博士，教授，研究方向：代谢组学，E-mail:chaoyan@unimicrotech.com。

上海市科委应用方法开发项目(12142201400)；国家重大科学仪器设备开发专项(2011YQ150072)。

TS201.7

A

1002-0306(2016)03-0312-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.057