双歧杆菌对母婴分离大鼠成年后肠道敏感性及结肠脑源性神经营养因子表达的影响

许绍娴， 秦　斌， 董　蕾*， 张涛红， 王　华， 杨素贞

(1西安交通大学第二附属医院消化内科，西安　710004； 2西安交通大学第一附属医院妇产科； *通讯作者，E-mail:dong556@126.com)



双歧杆菌对母婴分离大鼠成年后肠道敏感性及结肠脑源性神经营养因子表达的影响

许绍娴1， 秦斌1， 董蕾1*， 张涛红2， 王华1， 杨素贞1

(1西安交通大学第二附属医院消化内科，西安710004；2西安交通大学第一附属医院妇产科；*通讯作者，E-mail:dong556@126.com)

目的研究双歧杆菌干预对母婴分离大鼠成年后内脏敏感性与脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响。方法新生期SD大鼠随机分成正常组(NS)、模型组(MS)、双歧杆菌组(MS+Bif)和溶剂对照组(MS+vehicle)，通过新生期母婴分离建立大鼠肠道高敏感性模型。新生鼠断奶后双歧杆菌组及溶剂对照组给予灌胃干预。至大鼠成年(8周龄)时通过阶梯体积(0,0.4,0.8,1.2 ml)直肠球囊扩张评价四组大鼠内脏敏感性。蛋白质印迹法检测大鼠结肠BDNF的表达，免疫组织化学检测肥大细胞及类胰蛋白酶表达。结果与正常组比较，模型组VMR值在0.8 ml、1.2 ml显著升高(P<0.01)，BDNF表达显著升高(P<0.01),肥大细胞计数及类胰蛋白酶表达均显著升高(P<0.01)。与模型组和溶剂对照组比较，双歧杆菌组VMR值在0.8 ml、1.2 ml显著降低(P<0.01或P<0.05)，BDNF表达显著降低(P<0.05),肥大细胞计数及类胰蛋白酶均显著降低(P<0.01)。结论BDNF参与母婴分离模型大鼠内脏高敏感性的发生，双歧杆菌干预可降低大鼠成年后BDNF表达而改善内脏高敏感性。

脑源性神经营养因子(BDNF)；内脏高敏感性；双歧杆菌；母婴分离

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种常见的功能性胃肠病，表现为消化道感觉和动力异常，以慢性反复发作的腹痛或腹部不适伴有排便习惯改变，而无器质性病变及生物学异常证据为特征。内脏高敏感(visceral hypersensitivity, VH)是IBS的一个重要特征。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一种内源性神经营养因子，不仅与神经的生长发育相关，还与躯体/内脏疼痛及高敏感性的发生密切相关[1,2]。研究发现很多IBS患者存在有肠道菌群失调，益生菌能够调节肠道菌群失调，并显著改善IBS和炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)患者相关症状[3]。动物实验中也可发现肠道微生物环境的改变，早期应用益生菌可改善IBS大鼠肠道敏感性[4,5]，其机制可能与改变大鼠结肠调节疼痛和炎症基因的表达有关[6]。本研究通过早期双歧杆菌干预母婴分离大鼠肠易激模型，观察大鼠内脏敏感性及BDNF的变化，为进一步研究IBS的病理生理机制及治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物

初产的健康SPF级Sprague-Dawley大鼠孕鼠6只，受孕13-14 d，由西安交通大学医学部动物实验中心提供，饲养于西安交通大学医学部动物实验中心，每只孕鼠单独饲养，自由饮食饮水，饲养室温度为20-25 ℃，湿度为(50±5)%，光照周期为12 h∶12 h。实验动物生产许可证号：SCXK(陕)08-018。动物实验符合西安交通大学医学部动物实验中心管理委员会有关动物管理和使用规定。

1.2主要试剂

兔抗大鼠BDNF, GAPDH抗体(沈阳万类生物有限公司)；小鼠抗大鼠MCT抗体(英国Abcam)；双歧杆菌(自金双歧片中分离, 内蒙古双岐药业)；蛋白提取试剂盒、上样缓冲液(西安赫特生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝胶试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；Tris-Base, SDS, 甘氨酸(美国Sigma-Aldrich)。1.3大鼠母婴分离

采用母婴分离建立大鼠肠易激综合症内脏高敏感模型[7]，新生SD大鼠从出生后第2-12天，每天早上9：00-12:00将幼鼠从母鼠笼中取出分离3 h，单独置于大鼠饲养笼中，控制温度在30-33 ℃，第13天开始与母鼠共同饲养，正常组幼鼠出生后与母鼠共同饲养，不做分离处理。所有实验幼鼠至第23天断奶，第30天雌雄分笼饲养。

1.4动物分组与干预

新生期SD大鼠随机分成正常组(NS)、模型组(MS)、双歧杆菌组(MS+Bif)和溶剂组(MS+Vehicle)。新生鼠断奶后，双歧杆菌组每天给予双歧杆菌灌胃(107CFU/ml，剂量参照文献[8]中所述)，溶剂组给予相应体积溶剂作为对照。至大鼠成年(8周龄)时测定四组大鼠内脏敏感性。

1.5内脏敏感性检测

根据文献[9]中描述方法，采用Power Lab电生理记录分析仪和生物电放大器记录在阶梯体积球囊扩张下大鼠腹外斜肌的放电活动(VMR)，VMR记录结果使用Chart5.0软件进行测量计算，采用扩张过程中20 s的曲线下面积(AUC)减去扩张前基线期20 s的面积。将正常组大鼠0.4 ml扩张时AUC设为参照AUC(control)。VMR相对值为[扩张中20 s的AUC-扩张前基线期20 s内AUC]/参照AUC。内脏敏感性检测结束后，水合氯醛麻醉处死动物，腹主动脉取血并留取结肠标本于-80 ℃保存。

1.6Western blot 检测结肠BDNF表达

大鼠结肠组织按照每100 mg组织加入1 000 μl RIPA裂解液提取总蛋白，应用SDS-PAGE凝胶电泳检测结肠BDNF表达，通过Gel-Pro软件分析，与内参的灰度比值作为其相对表达水平。

1.7免疫组化检测结肠MCT表达

沿着肠道纵轴连续切片，每组随机选取切片，进行免疫组织化学染色：脱蜡，水化，抗原修复，一抗4 ℃孵育过夜，孵育二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水封片。镜下观察，每组取5个视野下免疫阳性细胞数进行统计，通过image plus pro软件计算积分光密度值，作为目的蛋白表达水平。

1.8统计学分析

2　结果

2.1双歧杆菌对母婴分离大鼠内脏敏感性的影响

与正常组相比，模型组在0,0.4 ml体积球囊扩张时VMR无明显差异(P>0.05)，在0.8 ml,1.2 ml时VMR显著增高(P<0.01)；与模型组相比，双歧杆菌组在0.8 ml,1.2 ml时VMR显著降低(P<0.01)；与模型组相比，溶剂对照组在0, 0.4, 0.8和1.2 ml时VMR均无明显差异(P>0.05)；与溶剂对照组相比，双歧杆菌组在0.8 ml和1.2 ml时VMR显著降低(P<0.05,见图1)。

2.2双歧杆菌对母婴分离大鼠结肠BDNF表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠组织BDNF水平显著升高(P<0.01)。双歧杆菌组大鼠结肠组织BDNF表达水平与模型组比较显著降低(P<0.05)，并与溶剂对照组存在显著性差异(P<0.05，见图2)。

NS：正常组；MS：模型组；MS+Bif：双歧杆菌组；MS+vehicle：溶剂对照组；与正常组比较，#P<0.01；与模型组比较，*P<0.01；与溶剂对照组比较，△P<0.01图1　双歧杆菌对母婴分离大鼠内脏敏感性的影响Figure 1　Effect of bifidobacterium on visceromotor response in maternal-separated rats

NS：正常组；MS：模型组；MS+Bif：双歧杆菌组；MS+vehicle：溶剂对照组；与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05；与溶剂对照组比较，#P<0.05图2　双歧杆菌对母婴分离大鼠结肠BDNF表达的影响Figure 2　Effect of bifidobacterium on expression of BDNF in maternal separated rats

2.3双歧杆菌对母婴分离大鼠结肠肥大细胞计数及类胰蛋白酶表达的影响

与正常组比较，模型组肥大细胞数目及类胰蛋白酶表达均显著升高(P<0.01)；双歧杆菌组肥大细胞数目及类胰蛋白酶表达与模型组比较均显著降低(P<0.01)，与溶剂对照组存在显著差异(P<0.01，见图3，4)。

图3　双歧杆菌对母婴分离大鼠结肠类胰蛋白酶表达的影响 (免疫组化染色，×200)Figure 3　Effect of bifidobacterium on expression of MCT in maternal separated rats (IH，×200)

NS：正常组；MS：模型组；MS+Bif：双歧杆菌组；MS+vehicle：溶剂对照组；与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，ΔP<0.01；与溶剂对照组比较，#P<0.01图4　双歧杆菌对母婴分离大鼠结肠肥大细胞计数及类胰蛋白酶表达的影响Figure 4　Effect of bifidobacterium on mast cells number and expression of MCT in maternal-separated rats

3　讨论

肠易激综合征发病机制尚不明确，目前普遍认为与内脏敏感性增加、肠道免疫失调、肠道微生态改变、心理应激、肠道微小炎症、肠黏膜通透性改变、神经内分泌因子异常等病理生理改变有关。内脏敏感性的增高认为是肠易激综合征的主要病理生理机制之一，即内脏对刺激的反应性增高，引起腹痛或腹部不适的症状。

内脏敏感性由神经、体液因子共同调控。肠神经系统(enteric nervous system，ENS)由胃肠道壁内神经成分组成，合成并释放多种神经因子，参与调节胃肠道感觉及运动功能。体液因子5-HT、NO、CRH等均参与内脏高敏感性的形成。BDNF是一种内源性神经营养因子，BDNF不仅与肠神经的生长发育相关，还参与内脏的运动及痛觉感知功能，同时参与焦虑抑郁情绪的调节。炎症等刺激引起BDNF释放增加，其作用于ENS，促进兴奋性神经递质释放，也可通过与NGF、CGRP等神经因子相互作用，导致内脏高敏感性的形成。动物实验证实，慢性避水应激可使大鼠结肠BDNF表达增加，致其内脏高敏感性形成[10]。本研究通过母婴分离建立IBS动物模型，证实母婴分离大鼠成年后表现为内脏高敏感，同时，与正常对照组比较，模型大鼠结肠组织BDNF水平升高，提示母婴分离大鼠成年后异常表达的BDNF参与其内脏高敏感的形成。

肥大细胞是一种免疫细胞，主要分布于结肠黏膜及黏膜下层，贮存和分泌多种生物活性介质，如类胰蛋白酶、组胺等，这些产物通过调节肠黏膜局部免疫和通透性参与IBS的发生。研究发现类胰蛋白酶在IBS结肠黏膜含量增多，而类胰蛋白酶主要合成于肥大细胞，活化释放后可以作用于肠道神经元上蛋白激活酶受体PAR-2，参与调节肠道运动、感觉及黏膜通透性等生理过程[11,12]。另一研究表明，肥大细胞活化促进小胶质细胞表达BDNF，而P2X4R表达于小胶质细胞，这一效应依赖于肥大细胞活化产物类胰蛋白酶作用于该受体[13]。本研究通过早期生活应激事件(母婴分离)建立大鼠内脏高敏感模型，发现模型大鼠肥大细胞数量及类胰蛋白酶表达增多，提示肥大细胞活化及其活化产物参与内脏高敏感性形成。

肠道菌群失调可能是IBS发病的一个危险因素。研究发现，应激可导致肠道菌群失调[8]，微生态制剂的单独使用或者联合其他药物可以改善肠道菌群紊乱状态，改善腹痛、腹胀等腹部症状及大便不成形，对部分IBS患者有效。微生态制剂的作用机制可能是通过建立正常菌群、抑制肥大细胞脱颗粒及炎症反应、调节肠道通透性增强肠黏膜屏障等。本研究结果表明，早期给予双歧杆菌干预可降低BDNF及类胰蛋白酶表达，改善IBS大鼠内脏高敏感性。双歧杆菌的这种作用可能是通过抑制肥大细胞活化，减少类胰蛋白酶作用于P2X4R，从而减少小胶质细胞表达BDNF。

综上所述,新生期母婴分离大鼠成年后表现为内脏高敏感，同时结肠组织BDNF表达水平增高，早期给予双歧杆菌干预可逆转这一改变，并改善IBS大鼠成年后内脏高敏感性，通过肥大细胞抑制小胶质细胞BDNF表达是其可能的作用机制之一。

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Effect of bifidobacterium on maternal separation-induced visceral hypersensitivity and brain-derived neurotrophic factor expression in adult rats

XU Shaoxian1, QIN Bin1, DONG Lei1*, ZHANG Taohong2, WANG Hua1, YANG Suzhen1

(1DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2DepartmentofObstetricsandGynecology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:dong556@126.com)

ObjectiveTo investigate the effects of bifidobacterium on brain-derived neurotrophic factor(BDNF) expression and visceral hypersensitivity in maternal-separated rats.MethodsNeonatal rats were divided into four groups: maternal separation group(model group), normal group, bifidobacterium group(MS+Bif) and vehicle control group(MS+vehicle). Maternal separation was used to establish visceral hypersensitivity in rats. After weaning, rats received bifidobacterium or vehicle daily in bifidobacterium group(MS+Bif) and vehicle control group(MS+vehicle). At 8 week, visceral sensitivity was measured as the visceromotor response(VMR) to colorectal distension(CRD) caused by balloon dilation by a graded volume of water(0,0.4,0.8,1.2 ml). Western blot was performed to investigate the expression of BDNF. Immunohistochemistry was used to investigate the number of MCT positive mast cells and level of tryptase.ResultsCompared with normal group, both VMR were significantly increased at 0.8 ml, 1.2 ml in model group(P<0.01), and the MCT positive mast cells, BDNF protein expression and tryptase levels were also increased(P<0.01). Compared with model group and vehicle control group, the VMR were significantly decreased at 0.8 ml, 1.2 ml in bifidobacterium group(P<0.01),and the MCT positive mast cells,BDNF expression and tryptase levels were decreased significantly(P<0.01orP<0.05).ConclusionThe increased expression of BDNF may contribute to visceral hypersensitivity in maternal-separated rats, which can be reversed by bifidobacterium.

brain-derived neurotrophic factor(BDNF);visceral hypersensitivity;bifidobacterium;maternal separation

“十二·五”国家科技支撑计划子课题资助项目(2012BAJl8B03-03)

许绍娴，女，1991-01生，在读博士，E-mail：xushaoxian2013@163.com

2016-04-14

R574

A

1007-6611(2016)08-0715-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.009