沙格雷酯对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉TGF-β1/Smads信号通路的影响

韩新源， 陈春燕， 解　翠， 王飞宇， 李秀红， 田红燕*

(1陕西省人民医院心内科，西安　710068； 2西安交通大学第一附属医院周围血管科； *通讯作者，E-mail：tianhhyy@126.com)



沙格雷酯对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉TGF-β1/Smads信号通路的影响

韩新源1， 陈春燕2， 解翠1， 王飞宇1， 李秀红1， 田红燕2*

(1陕西省人民医院心内科，西安710068；2西安交通大学第一附属医院周围血管科；*通讯作者，E-mail：tianhhyy@126.com)

目的观察盐酸沙格雷酯(5-HT2A受体拮抗剂)对野百合碱肺动脉高压模型大鼠肺动脉结构和肺动脉TGF-β1/Smads信号分子表达的影响。方法SD大鼠随机分为对照组、肺动脉高压模型组(模型组)及沙格雷酯干预组(沙格雷酯组)。其中模型组和沙格雷酯组采用野百合碱单次腹腔注射法建立肺动脉高压大鼠模型；同时，沙格雷酯组再给予盐酸沙格雷酯灌胃。干预21 d时分别测定平均肺动脉压力(mPAP)，计算右心肥厚指数，HE染色观察肺动脉结构的变化；采用Mallory三色染色评估肺动脉纤维化程度；Western blot检测肺动脉转化生长因子β1(TGF-β1)及其下游分子磷酸化的Smad3蛋白的表达水平，以评估TGF-β1/Smad3信号通路的活化。结果与对照组相比，干预21 d时模型组大鼠的mPAP、右室肥厚指数明显升高(P<0.05)；肺组织HE染色结果显示，模型组肺动脉管壁明显增厚，管腔狭窄，纤维组织增生；肺动脉中TGF-β1、p-Smad3蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组相比，沙格雷酯组mPAP、右室肥厚指数明显降低(P<0.05)；管腔狭窄程度也明显改善，肺动脉管壁纤维化程度减低(P<0.01)；肺动脉中TGF-β1、p-Smad3蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论沙格雷酯抑制野百合碱动物模型的肺动脉纤维化及改善肺动脉高压程度，这一作用可能是通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路的活化而实现的。

沙格雷酯；肺动脉高压；5-羟色胺；转化生长因子；肺血管重构

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)进展迅速、预后差，是恶性程度很高的一类肺血管疾病[1]。其病因多、发病机制复杂，目前已发现，肺动脉重构是肺动脉高压的主要病理改变之一[2]。肺动脉重构以血管壁各层包括内膜、中膜、外膜不同程度的增厚为特征，导致管腔狭窄、阻力增高。其中细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积的增加参与中膜、外膜的增厚[3,4]。研究显示转化生长因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)能通过激活其下游Smads蛋白，调控相关细胞外基质合成基因的转录，在心脏、肝脏、肺及肾脏等多种组织器官中参与纤维化的形成[5]。5-羟色胺(serotonin，5-HT)是一种重要的血管活性物质，既往的研究结果显示5-HT能够通过与5-HT受体和5-HT转运体结合参与肺动脉高压的形成和发展[6]。前期的研究发现，5-HT2A受体拮抗剂盐酸沙格雷酯干预PAH大鼠，能够预防大鼠的肺血管重构[7]。然而，在肺动脉高压时，5-HT是否在肺血管纤维化中发挥作用及具体的分子机制，尚不清楚。本研究采用野百合碱诱导的PAH大鼠模型，观察了5-HT2A受体阻滞剂盐酸沙格雷酯对PAH时肺动脉结构的改善作用，以及对肺动脉TGF-β1/Smads通路表达的影响，为寻找肺动脉高压新的治疗靶点提供实验依据。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器

野百合碱(美国Sigma公司)、盐酸沙格雷酯片(日本三菱制药株式会社)、蛋白定量试剂盒(BCA法)(美国BIO-RAD公司)、TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗体(美国Abcam公司)、Smad3及p-Smad3兔抗大鼠多克隆抗体(美国CST公司)。BL-420E生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，动物小型呼吸机(成都泰盟科技有限公司)，数码摄像显微镜(日本Olympus公司)，凝胶成像分析系统ChemiDocTM XRS(美国Bio Rad公司)。

1.2动物模型的建立与干预

雄性清洁级SD大鼠50只，体重(190±9)g，购自西安交通大学医学院动物实验中心。随机分为对照组(10只)，肺动脉高压模型组(模型组，20只)，盐酸沙格雷酯干预组(沙格雷酯组，20只)，三组均用标准饲料在同等条件下喂养。对照组按60 mg/kg腹腔注射生理盐水，模型组、沙格雷酯组按60 mg/kg腹腔一次性注射野百合碱造模。第2天，沙格雷酯组给予盐酸沙格雷酯灌胃(150 mg/kg，1次/d)，对照组、模型组用等体积的生理盐水灌胃。干预21 d对照组大鼠无死亡，模型组死亡10只，沙格雷酯组死亡3只，从沙格雷酯组剩余大鼠中随机抽取10只进行后续实验及数据分析。

1.3肺动脉压力及右心指数测定

大鼠麻醉后开胸，用蓝色留置针穿入肺动脉主干，BL-420生物信号采集系统记录mPAP。记录完毕后处死大鼠，将胸腔剪开，分离右心室(RV)与左心室和室间隔(LV+S)，称重并计算右心室肥厚指数=RV/(LV+S)×100%。

1.4肺组织形态学观察

将4%多聚甲醛中固定的肺组织标本脱水、透明、常规石蜡包埋后切片(5 μm)。将组织切片行HE染色，用显微镜观察动脉管壁厚度。采用IPP图像分析软件测量肺小动脉管壁厚度，计算肺动脉管壁厚度百分比(WT%)。

组织脱蜡至水同HE染色，组织切片行Mallory染色，光镜下观察，胶原纤维为蓝色。采用IPP图像彩色分析系统对各组切片中肺动脉管壁进行图像分析，测定血管壁的胶原纤维面积，计算胶原纤维面积百分比(胶原指数)。

1.5Western blot检测蛋白的表达

用RIPA裂解液匀浆、离心后获得肺小动脉总蛋白，BCA试剂盒测量组织蛋白浓度后，进行蛋白变性。SDS-PAGE垂直电泳，经电转移方式转置PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入一抗，分别为TGF-β1(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶1 000)、Smad3(1 ∶1 000)、p-Smad3(1 ∶1 000)，4 ℃过夜孵育，洗去抗体后置于二抗中反应2 h，经TBST充分洗涤后，染色，化学显影。用Quantity One成像分析系统进行WB条带的灰度值分析。

1.6统计学分析

应用SPSS17.0统计软件进行数据处理。数据以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1肺动脉压力、右心肥厚指数的变化

模型组大鼠mPAP较对照组明显增高(P<0.05)，提示PAH模型复制成功；与模型组相比，沙格雷酯组mPAP显著降低(P<0.05，见图1A)。与对照组相比，模型组大鼠右心室肥厚指数明显增高(P<0.05)，结合模型组mPAP升高，进一步提示PAH模型复制成功；与模型组比较，沙格雷酯组明显降低(P<0.05，见图1B)。

A.三组大鼠肺动脉mPAP比较　　　　　　　　B.三组大鼠肺动脉右心肥厚指数比较与对照组比较*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05图1　三组大鼠的mPAP及右心肥厚指数比较Figure 1　Comparison of mPAP and right ventricular hypertrophy index among three groups

2.2肺组织形态学变化

HE染色光镜下可见，对照组大鼠肺组织肺动脉管壁结构清楚，厚度正常，外膜未见血管外基质沉积(见图2A)。模型组大鼠肺组织切片肌型肺动脉管壁明显增厚，平滑肌增生肥厚明显，外膜可见血管外基质沉积，管腔狭窄(见图2B)；沙格雷酯组肺动脉管壁无明显增厚，肺动脉外膜周围可见少量血管外基质沉积(见图2C)。采用IPP图像分析软件测量并计算肺动脉管壁厚度百分比(WT%)，统计结果显示：模型组大鼠肺小动脉WT%较对照组明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；沙格雷酯组大鼠肺小动脉WT%较模型组明显降低(P<0.01，见图3)。

A.对照组　　　　　　　　　　　　B.模型组　　　　　　　　　　C.沙格雷酯组图2　三组大鼠肺组织HE染色 (标尺=50 μm)Figure 2　Hematoxylin-eosin stain of pulmonary tissues in three groups (bar=50 μm)

与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01图3　三组大鼠肺动脉管壁厚度百分比(WT%)比较Figure 3　Comparison of the percent arterial wall thickness of pulmonary arteries among three groups

2.3肺动脉纤维化的观察

Mallory 三色染色结果显示，在对照组大鼠肺组织内可见仅少数小动脉血管壁出现蓝紫色着色组织，系小动脉管壁胶原纤维被苯胺蓝所染(见图4A)；模型组大鼠肺组织内有大量蓝紫色着色，提示肺组织内大量胶原纤维增生；肺小动脉管壁胶原纤维增生明显(见图4B)。沙格雷酯组肺动脉管壁胶原纤维增生较模型组明显减少(见图4C)。对蓝紫色着色的胶原纤维面积进行统计，结果示模型组大鼠肺血管周围胶原面积百分比较对照组明显升高(P<0.01)；沙格雷酯组大鼠肺血管周围胶原面积百分比较模型组则明显下降(P<0.01，见图5)。

A.对照组　　　　　　　　　　B.模型组　　　　　　　　C.沙格雷酯组图4　大鼠肺动脉Mallory染色图 (标尺=50 μm)Figure 4　Mallory trichrome staining of pulmonary arteries in the three groups (bar=50 μm)

与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01 图5　三组大鼠肺动脉胶原面积百分比的比较Figure 5　Comparison of the pulmonary arterial collagen area among three groups

2.4肺动脉中TGF-β1、p-Smad3的表达

经Western blot方法检测发现，PAH大鼠肺动脉TGF-β1和p-Smad3的表达明显增加(P<0.01vs对照组)；而用盐酸沙格雷酯干预部分阻断5-HT的作用后，则能够降低肺动脉TGF-β1和p-Smad3的蛋白表达(图6)。

3　讨论

尽管有关PAH的确切发生机制目前仍然不明，但是广泛认可的所有类型PAH的共同标志为肺血管的收缩和重构。肺血管重构以血管壁各层包括内膜、中膜、外膜不同程度的增厚以及前毛细血管动脉的细胞表达平滑肌特异性的标志物为特征。其中，中膜的增厚是由于平滑肌细胞的肥大、聚集增加以及细胞外基质蛋白的沉积增加，主要是胶原蛋白和弹性蛋白。外膜增厚则是由成纤维细胞和肌成纤维细胞的聚集和细胞外基质(胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、固生蛋白)沉积明显增加造成的[3,4]。血管壁细胞外基质的生成增多导致管壁纤维化，从而使得血管壁的结构和功能发生明显的改变。本研究发现野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠mPAP和右心室肥厚指数明显增加，说明PAH模型构建成功，进一步的病理染色结果显示，肺动脉管壁明显增厚，管腔狭窄，此外，血管壁纤维组织明显增加。提示PAH大鼠血管壁纤维化参与肺动脉高压的过程。

与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01图6　大鼠肺动脉TGF-β1/Smad3通路激活情况Figure 6　The expression of TGF-β1/Smad3 signal pathway in pulmonary artery in the three groups

TGF-β1是具有多种功能的细胞因子，参与体内多种病理和生理过程，对血管发育和血压稳态维持起到重要作用。既往研究结果显示，阻断TGF-β1的表达，细胞外基质的表达也明显受到抑制，提示TGF-β1刺激成纤维细胞的表型转化和细胞外基质的沉积，在血管重构过程中起着关键作用[8]。本研究观察到，在PAH大鼠肺动脉中的TGF-β1表达水平明显升高，初步证实TGF-β1诱导的信号通路参与PAH大鼠肺动脉的纤维化过程。Smads蛋白是TGF-β1下游的重要信号分子，Smad3是Smads信号蛋白家族中的关键蛋白，在TGF-β1/Smad信号传导通路中具有核心地位[9]。研究显示，TGF-β1/Smad3信号通路的过度激活，是导致机体内肝脏和心脏等组织发生进行性增殖和纤维化病变的关键所在[10,11]。

本研究结果进一步观察到PAH大鼠肺动脉的Smad3磷酸化水平显著增高，进一步证实在PAH大鼠肺动脉中TGF-β1/Smad3信号通路呈显著活化状态。

5-HT是机体内一类重要的单胺类神经递质，近年来研究发现，5-HT在肺血管重构中起重要作用。5-HT发挥调节作用主要是通过与相应的受体结合，已有证据证实5-HT1B、5-HT2A、5-HT2B受体与PAH肺动脉重构相关[12]。本课题组前期的研究已经证明，5-HT可以通过5-HT2A受体促进肺动脉中膜平滑肌细胞增殖、抑制凋亡，参与肺动脉重构[7]。本研究进一步表明5-HT2A受体拮抗剂盐酸沙格雷酯干预能够预防MCT诱导PAH大鼠肺动脉压力增高、右室肥厚和肺动脉管壁增厚，而且使肺动脉管壁胶原生成减少，同时对其可能的分子生物学机制做了初步探讨，结果显示，5-HT2A受体拮抗剂盐酸沙格雷酯能够显著抑制肺动脉高压大鼠肺动脉TGF-β1及其下游p-Smad3的产生，这可能是5-HT2A受体阻断剂抗PAH的机制之一。继往已有研究结果显示，在肾小球系膜细胞及心肌成纤维细胞中，5-HT能促进TGF-β1的表达从而发挥促纤维化的作用[13，14]。

总之，在PAH的发生发展过程中，肺动脉纤维化在肺动脉重构中也扮演着重要的角色。本研究结果表明，5-HT2A受体阻滞剂盐酸沙格雷酯能够降低肺动脉压力，减轻肺动脉纤维化、改善肺动脉重构，并观察到TGF-β1/Smads信号通路可能是其作用的分子机制之一。研究结果进一步补充完善PAH的发病机制，并为盐酸沙格雷酯在PAH治疗中的应用提供初步的理论基础。

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Effects of sarpogrelate on the TGF-β1/Smads signal pathway in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension rats

HAN Xinyuan1, CHEN Chunyan2, XIE Cui1, WANG Feiyu1, LI Xiuhong1, TIAN Hongyan2*

(1DepartmentofCardiology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;2DepartmentofCardiovascularMedicine,FirstAffiliatedHospitalofMedicalCollege,Xi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:tianhhyy@126.com)

ObjectiveTo explore the effects of sarpogrelate(5-HT2Areceptor antagonist) on the structure of pulmonary artery and the TGF-β1/Smads signal pathway in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension(PAH) rats.MethodsThe rats were divided into control group，model group and sarpogrelate group. The rats were intraperitoneally injected with monocrotaline(MCT) once to induce the pulmonary artery hypertension in model group on and sarpogrelate group，and then the rats were additionally given sarpogrelate by gavage in sarpogrelate group. On the 21st day after treatment, the mean pulmonary arterial pressure(mPAP) was measured and the right ventricular hypertrophy index was calculated. HE staining method was used to observe the morphologic changes of peripheral pulmonary artery. Mallory trichrome staining was used to evaluate the extent of pulmonary arterial wall fibrosis. Western blot was used to detect the TGF-β1 and p-Smad3 protein expression in pulmonary arteries.ResultsCompared with control group, the mPAP and right ventricular hypertrophy index were increased in model group on the 21st day after treatment(P<0.05), the pulmonary arterial wall became thick and the deposition of collagen drastically increased, and the protein levels of TGF-β1 and p-Smad3 were elevated(P<0.01). Compared with model group, the mPAP and RV hypertrophy decreased in sarpogrelate group(P<0.05), the PA wall became thin and the fibrosis of pulmonary arterial wall was decreased(P<0.01). The protein levels of TGF-β1and p-Smad3 in PA were significantly lower in sarpogrelate group than in model group(P<0.01).ConclusionSarpogrelate can improve the fibrosis and pulmonary arterial hypertension in PAH rats and TGF-β1/Smads signal pathway may be involved in this process．

sarpogrelate;pulmonary artery hypertension;serotonin;transforming growth factor;pulmonary ventricular remodeling

国家自然科学基金资助项目(81170294)

韩新源，男，1980-04生，博士，主治医师，E-mail：hanxinyuan0408@163.com

2016-06-03

R543.2

A

1007-6611(2016)08-0706-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.007