琥珀酸对幼龄大鼠小脑谷氨酸能突触传递的抑制作用

何海燕， 陈　静， 晋芙丽， 李　凌， 杜永平△， 张月萍*

(1第四军医大学西京医院儿科脑发育研究室，西安　710032； 2陕西省安康市妇幼保健院新生儿科；3第四军医大学西京医院全军中医内科中心；*通讯作者，E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn; △共同通讯作者，E-mail:ddyypp@fmmu.edu.cn)



琥珀酸对幼龄大鼠小脑谷氨酸能突触传递的抑制作用

何海燕1,2， 陈静3， 晋芙丽1， 李凌1， 杜永平3△， 张月萍1*

(1第四军医大学西京医院儿科脑发育研究室，西安710032；2陕西省安康市妇幼保健院新生儿科；3第四军医大学西京医院全军中医内科中心；*通讯作者，E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn;△共同通讯作者，E-mail:ddyypp@fmmu.edu.cn)

目的探讨琥珀酸(succinic acid，SA)对幼龄大鼠小脑谷氨酸能突触传递的影响。方法采用全细胞膜片钳记录法，在矢状位小脑脑片上记录浦肯野细胞(Purkinje cells，PCs)自发性微小兴奋性突触后电流(miniture excitatory postsynaptic current，mEPSC)和刺激平行纤维(parallel fibre，PF)诱发的PCs兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)，比较琥珀酸处理前后mEPSC和PF-PC EPSP的变化。结果琥珀酸处理后,幼鼠小脑PCs的自发性mEPSCs幅值显著减小，由给药前的(24.85±2.78)pA减小至给药后的(13.14±0.84)pA，频率也由给药前的(5.04±1.07)Hz降至给药后的(2.77±0.79)Hz，差异均有统计学意义(P<0.01)；琥珀酸显著抑制了PF-PC EPSPs的幅值，使其降低至用药前的(37.76±1.10)%(P<0.01)，并使EPSP双脉冲(paired-pulse facilitation，PPF)增强的比率较用药前增加了(40.26±2.9)%(P<0.01)，差异均有统计学意义。结论 琥珀酸对幼龄大鼠小脑谷氨酸能突触传递有显著的抑制作用。

琥珀酸；浦肯野细胞；谷氨酸；自发性微小兴奋性突触后电流；兴奋性突触后电位

惊厥是新生儿常见的神经系统症状[1]。出生后早期即使是单次惊厥，也有可能引起脑内谷氨酸能突触传递的持久性改变[2]。越来越多的研究显示出生后早期使用传统抗惊厥药如苯巴比妥、地西泮、苯妥英钠等对未发育脑可能造成远期的功能损害[3]。因此，如何权衡惊厥后果和药物伤害是新生儿科医生面临的艰难抉择，研发具有神经保护作用的抗惊厥药有重要的临床意义。

琥珀是传统的镇惊安神类中药，自古以来用于治疗惊厥。琥珀酸(succinic acid，SA)是琥珀的主要成分。动物实验研究表明，腹腔注射10-12 mmol/L SA可对抗多种方法造成的动物惊厥[4]。SA位于三羧酸循环和脑内特有的谷氨酸-γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)-SA代谢旁路的枢纽地位，不仅在脑的能量代谢中具有特殊地位，而且有利于维持脑内突触传递的兴奋-抑制平衡[5]。研究发现，SA能抑制GABA和琥珀酸半醛之间的互变反应，升高惊厥动物脑内的GABA水平，增强中枢抑制，也可增加脑内谷氨酸脱羧酶活性，降低谷氨酸水平，抑制中枢兴奋[6]。然而，与SA通过增强GABA介导的抑制性突触传递发挥中枢抑制作用的研究相比，较少有人关注SA对谷氨酸能突触传递的影响。

本课题组以前的研究表明，腹腔注射琥珀酸可逆转惊厥SD大鼠幼鼠小脑浦肯野细胞(Purkinje cells，PCs)兴奋性突触后电流的近远期的长时程抑制(long term depression，LTD)强化现象[7]，提示琥珀酸在有效抗惊厥的同时，对惊厥造成的发育脑的谷氨酸能突触可塑性异常有对抗作用。本研究在幼龄大鼠小脑组织切片上给药，探讨琥珀酸对平行纤维(parallel fibre，PF)-PC之间谷氨酸能突触传递的直接影响，为阐明琥珀酸的神经保护机制提高实验依据。

1　材料和方法

1.1实验动物及主要仪器

14-16日龄SPF级Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，由第四军医大学实验动物中心提供。渗透压测定仪(Model 210，FISKE ASSOCIATE，USA)，玻璃微电极拉制仪(P-97，Sutter Instrument，USA)，振动切片机(VT1000S，Leica)，正置显微镜(Zeiss，Axopatch，German)，放大器(Axon 700A，Axon Instrument，USA)，微电极操纵仪(Model 285，Sutter Instrument，USA)，模拟-数字转换器(Digidata1322A，Axon Instruments，USA)，刺激器(PG4000A，CYGNUS)，恒流泵(HL-2，上海泸西仪器厂)。

1.2主要试剂及溶液配制

NaCl、KC1、NaH2PO4·H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NaHCO3、葡萄糖(glucose)、葡萄糖酸钾(K-gluconate)、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、磷酸肌酸二钠(phosphoreatine disodium)、三磷酸腺苷二钠(Na2ATP)、三磷酸鸟苷酸钠(Na3GTP)、KOH、河豚毒素(TTX)、荷包牡丹碱(Bicuculline)、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)和琥珀酸(SA)，均购自Sigma公司。

人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分：NaCl 126.0 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，NaH2PO4·H2O 1.25 mmol/L，MgSO4·7H2O 2.0 mmol/L，CaCl2·2H2O 2.0 mmol/L，NaHCO326.0 mmol/L，Glucose 10.0 mmol/L，pH 7.35-7.45，渗透压310-320 mOsm/L。电极内液成分：K-gluconate 120.0 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，EGTA 5.0 mmol/L，CaCl2·2H2O 0.5 mmol/L，MgSO4·7H2O 2.0 mmol/L，phosphoreatine disodium 2.0 mmol/L，Na2ATP 4.0 mmol/L和Na3GTP 0.3 mmol/L，用浓度为0.5 mol/L的KOH调pH为7.35-7.45，渗透压280-290 mOsm/L。

1.3脑片制备

SD幼龄大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(30-40 mg/kg)麻醉后快速断头取脑，迅速置于充95%O2+5%CO2混合气的0 ℃ ACSF中，1 min取出，将小脑组织块修整后移入切片槽内固定，用振动切片机切出300-400 μm厚的矢状位脑片，立即转移至32 ℃的ACSF中孵育30 min，然后移至室温下继续孵育，以备记录。整个过程通以95%O2+5%CO2混合气体。实验操作及内容符合西京医院实验动物保护和使用委员会的规定。

1.4全细胞膜片钳记录和药物干预

将脑片移至记录浴槽内，先在低倍镜下确定小脑皮层的细胞层，然后在高倍镜下选择表面光滑、轮廓清晰、立体感强的PCs进行全细胞膜片钳记录。当电极尖端靠近PC时，给予合适的负压，形成1 GΩ以上高阻抗封接，继续施加吸破细胞膜，形成PC全细胞记录模式(见图1A)。玻璃微电极充灌内液后电阻为5-8 MΩ。记录过程中使用恒流泵持续向记录浴槽内灌注含95%O2+5%CO2混合气体的ACSF灌流液，流速为2 ml/min。

记录PCs微小突触后电流时，在电压钳状态下，钳制膜电位-70 mV，于ACSF灌流液中加入钠通道阻断剂河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)(1 μmol/L)阻断突触前细胞动作电位发放引起的微小突触后电流，同时加入GABA受体阻断剂荷包牡丹碱(bicuculline，Bic)(10 μmol/L)阻断微小抑制性突触后电流，即可记录到PCs自发性微小兴奋性突触后电流(miniture excitatory postsynaptic current，mEPSC)。稳定记录自发性mEPSC 5 min，转换为含有琥珀酸(0.1 μmol/L)的ACSF灌流5 min，然后转换为不含琥珀酸的ACSF灌流液，持续记录20 min。

记录PC兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)时，将充有ACSF的玻璃微电极置于小脑脑片的分子层(见图1B)，通过刺激器给予方波刺激(波宽0.1 ms，强度20-50 μA)，在电流钳状态下，可在PC上记录到PF兴奋引起的EPSPs。在正常ACSF灌流液灌流下稳定记录EPSP 10 min，用含有0.1 μmol/L琥珀酸的ACSF灌流5 min，再转换为正常ACSF灌流液，继续记录EPSPs 30 min以上。所有记录在室温(20-25 ℃)下进行。

图1　高倍镜下幼龄大鼠小脑脑片上的PC (×40)Figure 1　The PCs in the cerebellar slices of neonatal rats at high magnification (×40)

1.5统计学分析

2　结果

2.1琥珀酸对大鼠小脑PC自发性微小兴奋性突触后电流的影响

在电压钳模式下，钳制PCs膜电位为-70 mV。在TTX(1 μmol/L)和Bic(10 μmol/L)存在时，在小脑PC记录到的微小突触后电流即为自发性mEPSC。1个PC 自发性mEPSC对琥珀酸作用的典型反应，可见琥珀酸对PCs自发性mEPSC有明显的抑制作用(见图2)。在比较mEPSC幅值和频率的均值时，取SA灌流前的记录(5 min)为给药前对照，取SA灌流后15-20 min的记录作为给药后数据。在11个PCs上记录的结果显示，给药后自发性mEPSC的幅值及频率均明显降低，与给药前相比均差异有统计学意义(P<0.01，见表1)，表明琥珀酸显著抑制了PCs的自发性mEPSC。

2.2琥珀酸对大鼠小脑PF-PC突触传递的影响

电流钳状态下，给予PCs细胞内输入微小的超极化电流，使其膜电位保持在-70 mV，记录PF兴奋诱发的 EPSPs，这种EPSPs可以被谷氨酸α-氨基-3-羧基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA)受体阻断剂CNQX(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2，3-dione，CNQX)(10 μmol/L)阻断(见图3A上)，说明这种突触后反应是由AMPA受体介导的兴奋性突触后电位，以连续2个脉冲(间隔50 ms)刺激PF时，可见EPSP的双脉冲增强(paired-pulse facilita-tion，PPF)现象(见图3A下)。

给予琥珀酸5 min后，自发性mEPSC的频率和幅值均逐渐减小，a和b分别采自给予琥珀酸前后的mEPSC记录图2　琥珀酸抑制大鼠小脑PC自发性mEPSCFigure 2　Succinic acid inhibits spontaneous mEPSC on cerebellar PC of neonatal rats

组别幅值(pA,n=11)频率(Hz,n=11)对照组24.85±2.785.04±1.07琥珀酸组13.14±0.842.77±0.79 P<0.01<0.01

当用含琥珀酸的ACSF液灌流时，EPSPs的幅值迅速衰减，约于SA灌流后20 min，EPSPs幅值降低到最低点。停止琥珀酸灌流后观察40 min，EPSPs幅值仍未恢复，呈现为长时程抑制(见图3B、C)。比较EPSPs幅值时，取SA灌流前的记录为对照(10 min)数据，SA灌流后20-50 min期间记录给药后数据。结果发现，琥珀酸使PCs EPSP的幅值降低到用药前的(37.76±1.10)%(n=13，P<0.01，见表1)。同时，EPSPs的PPF比率较用药前增加了(40.26±2.9)%(n=8，P<0.01，见表2)。此结果表明琥珀酸显著抑制了PF兴奋诱发的PC EPSP，并使EPSP的PPF显著增强。

图3　琥珀酸对幼鼠小脑PF-PC EPSP的影响Figure 3　The effect of succinic acid on PF-PC EPSP on the cerebellum of neonatal rats

组别标准化幅值(%,n=13)PPF(%,n=8)对照组100.00±1.97155.25±14.80琥珀酸组37.76±1.10195.51±17.70 P<0.01<0.01

3　讨论

琥珀酸不仅存在于琥珀中，也存在于植物药如七叶莲和海洋生物如水藻中。琥珀酸作为一种抑制性神经活性物质，毒性小、来源广、价格低廉，不仅有良好的抗惊厥作用，还能改善大脑认知功能，这些优点恰好是化学合成的抗癫痫药所不具备的。因此，琥珀酸具有作为内源性抗惊厥、抗癫痫新药的潜在价值。

小脑一向被认为是皮层下的一个运动控制中枢，参与躯体平衡、运动协调和技巧动作的获得。而近几十年的研究发现脊椎动物的小脑也参与内脏功能调节和高级认知功能的形成[8,9]。因此，小脑是研究发育中的脑的一个重要脑区。小脑结构规整，环路清楚，小脑主神经元PC不仅接受来自平行纤维和攀纤维的强大的谷氨酸能兴奋性输入，同时也接受来自中间神经元的丰富的GABA能抑制性输入。所以，小脑也是研究突触活动的理想脑区[9]。

本研究首次在小脑脑片上观察了SA对幼龄大鼠小脑环路中最重要的谷氨酸能突触PF-PC之间突触传递的影响，结果发现SA可显著抑制PCs自发性mEPSCs和PF兴奋诱发的PC EPSP。mEPSC是在动作电位被阻断后，突触之间自发释放递质所形成的微小的兴奋性突触后电位。mEPSC其幅度及频率变化反应了突触后膜受体数目及突触前递质释放速度的改变[10]。SA对PCs自发性mEPSCs的幅值和频率均有显著的抑制，说明其抑制作用不仅涉及突触后谷氨酸受体的活性，也涉及突触前谷氨酸的释放速度。

PC PPF是指给予PF两次短暂间隔的脉冲刺激时，第二次刺激在PC上引发的EPSP幅值大于第一次刺激在PC上引发的EPSP幅值的现象，其主要原因是由于前一个脉冲刺激的易化，使后一个刺激引起的神经递质释放增加。所以PPF比率的变化反应突触前神经末梢释放神经递质的可能性。本研究结果显示SA在抑制AMPA受体介导的PF-PC EPSP的同时，增强了EPSP的PPF，说明SA对PF诱发的PC EPSP的抑制作用也涉及突触后和突触前机制。

本课题组以前的研究发现，在惊厥幼鼠小脑脑片上，低频刺激诱导的PF-PC LTD增强，而在腹腔注射琥珀酸的惊厥幼鼠脑片上，低频刺激诱导的PF-PC LTD接近正常，表明琥珀酸可对抗惊厥后小鼠PF-PC之间谷氨酸能突触传递的显著衰减[7]，这一结果与本研究中琥珀酸抑制PF-PC之间谷氨酸能突触传递的结果共同表明，琥珀酸对幼龄大鼠小脑PF-PC谷氨酸能突触传递的调节是双向的。

许多研究显示琥珀酸的抗惊厥作用是多方面的，如琥珀酸可通过增强突触前膜GABA的自发性释放，对海马CA1区神经元产生超极化作用，从而抑制癫痫发作[11]。刘艳霞[11]等观察到琥珀酸可增加脑内谷氨酸脱羧酶活性，升高脑内GABA水平[12]。琥珀酸也可通过减少Ca2+内流，抑制细胞内Ca2+超载触发的胞内级联反应而发挥抗惊厥和神经保护作用的[13]。本研究及我们以前的研究提示，琥珀酸对谷氨酸能突触传递的双向调节作用可能也是抗惊厥和神经保护作用的重要机制之一。

在小脑环路中，PC对其靶细胞(主要是小脑传出细胞)的抑制受PF兴奋性输入的调节：如果PF-PC的兴奋性突触传递增强，PC对其靶细胞的GABA能抑制也将增强；而PF-PC的兴奋性突触传递减弱，PC对其靶细胞的GABA能抑制也将减弱。如果PC的抑制性输出显著减弱，那么小脑传出细胞的兴奋性传出信号可能会显著增强。亦即：小脑PF-PC兴奋性突触传递的过度抑制可能会导致小脑传出细胞的轴突所到达脑区的过度兴奋。而琥珀酸对幼鼠小脑PF-PC谷氨酸能突触传递的双向调节，可能有利于维持小脑环路(PF-PC-小脑传出细胞)和小脑以外区域(小脑传出细胞-靶细胞)的兴奋/抑制平衡，这一猜测有待于进一步实验证实。

综上所述，本研究表明琥珀酸对幼鼠小脑PF-PC谷氨酸能突触传递有显著的抑制作用，突触前和突触后机制共同介导了这种兴奋性突触传递的抑制，这可能是琥珀酸抗惊厥和神经保护作用的重要机制之一。

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Inhibition of succinic acid on cerebellar glutamatergic synaptic transmission in neonatal rats

HE Haiyan1, 2, CHEN Jing3, JIN Fuli1, LI Ling1, DU Yongping3△, ZHANG Yueping1*

(1LaboratoryofBrianDevelopment,DepartmentofPediatrics,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2NeonatalUnit,AnkangMaternalandChildHealthHospitalinShannxiProvince;3DepartmentofTraditionalChineseMedicine;XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn;△Co-correspondingauthor,E-mail:ddyypp@fmmu.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the effects of succinic acid(SA) on the glutamatergic synaptic transmission in the neonatal rat cerebellum.MethodsThe whole-cell patch-clamp technique was carried out in Purkinje cells(PCs) of sagittal cerebellar slices to record the spontaneous miniture excitatory postsynaptic current(mEPSC) and the excitatory postsynaptic potential(EPSP) induced by parallel fiber(PF) stimulation. The changes of the mEPSC and the PF-PC EPSP upon SA were analyzed before and after SA perfusion.ResultsSA significantly reduced the amplitude[from(24.85±2.78)pA to(13.14±0.84)pA,P<0.01]and the frequency[from(5.04±1.07)Hz to (2.77±0.79)Hz,P<0.01] of the spontaneous mEPSCs. SA also significantly inhibited PF-PC EPSPs amplitude to (37.76±1.10)% of the control(P<0.01) and enhanced the EPSP paired-pulse facilitation(PPF) by(40.26±2.9)%(P<0.01).ConclusionSA may provide an inhibitory effect on cerebellar glutamatergic synaptic transmission in neonatal rats.

succinic acid;Purkinje cells;glutamic acid;miniture excitatory postsynaptic current;excitatory postsynaptic potential

何海燕，女，1983-10生，在读硕士，主治医师，E-mail:283348291@qq.com

2016-05-16

R748

A

1007-6611(2016)08-0698-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.005