一种溃疡性结肠炎相关性结肠癌小鼠模型的建立

张　瑞， 朱　娜， 马　静， 张文平， 刘近春， 原丽莉*

(1山西医学科学院，山西医科大学附属山西大医院消化内科，太原　030032； 2山西医科大学第二临床医学院； 3山西医科大学第一临床医学院； 4山西医科大学公共卫生学院； *通讯作者，E-mail:Dangyuan831@sina.com)



一种溃疡性结肠炎相关性结肠癌小鼠模型的建立

张瑞1,2， 朱娜1， 马静3， 张文平4， 刘近春3， 原丽莉1*

(1山西医学科学院，山西医科大学附属山西大医院消化内科，太原030032；2山西医科大学第二临床医学院；3山西医科大学第一临床医学院；4山西医科大学公共卫生学院；*通讯作者，E-mail:Dangyuan831@sina.com)

目的建立一种简单易行的溃疡性结肠炎相关的结肠癌小鼠模型。方法5周龄C57BL/6J雄性小鼠被分为实验组(n=10)和对照组(n=7)。实验组小鼠腹腔注射致癌剂氧化偶氮甲烷(AOM)10 mg/kg后给于致炎剂2%葡聚糖硫酸钠(DSS)饮水4 d，之后换为普通饮水17 d为1个周期，共3个周期结束；对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水。解剖镜大体观察结肠，并对结肠进行炎症评分、黏膜息肉评分和肿瘤病理评分，评分结果采用非配对t检验，检验水准取ɑ=0.05。结果实验组小鼠腹腔注射AOM后无明显变化，给予DSS后有50%小鼠出现血便，且逐渐加重，试验结束时小鼠表现为反应迟钝，活动减少，出现血便的小鼠均有脱肛。对照组小鼠无异常表现。实验组小鼠较对照组体重增长明显减缓。试验结束时，所有实验组小鼠远端及中段大肠出现不典型增生/癌变，大体解剖镜炎症评分、息肉评分和病理切片肿瘤评分均显著高于对照组(P<0.05)。结论致癌剂AOM和致炎剂DSS可诱导小鼠建立溃疡性结肠炎相关的结肠癌模型。

溃疡性结肠炎相关性结肠癌；氧化偶氮甲烷；葡聚糖硫酸钠；动物模型

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，发病率占胃肠道肿瘤的第3位，近年来呈现出上升趋势。结肠癌的发病与遗传、环境等因素有关，炎症性肠病患者、结肠息肉患者、有胆囊切除史的患者、男性肥胖者等为易感人群。炎症性肠病，如溃疡性结肠炎和克罗恩病是肠道的慢性炎症状态，常常伴随结肠癌发病率的增加。溃疡性结肠炎患者的结肠癌发生率是正常人群的5.7倍，且发病年龄提前[1]。随着我国饮食结构的改变，高热量、高蛋白、低纤维的食物摄入增多，食物中潜在的化学致癌剂容易诱发结肠肿瘤的发生。动物实验和流行病学实验研究表明，结肠癌的发生、发展与结肠的炎症程度、炎症范围及病程长短有密切关系，反复的炎症发作是恶性肿瘤形成的重要原因之一，但是其中的分子生物学，免疫病理学及遗传学等机制却不明确[2，3]，因而，探讨结肠炎发展为结肠癌的病理机制将有助于相关疾病的预防及治疗。由炎症向肿瘤发生、发展过程是研究肿瘤发病机制，因此建立炎症基础上的肿瘤模型对于研究这一过程非常重要。许多研究表明，肠道的慢性反复性炎症发作如溃疡性结肠炎会明显地增加结肠癌的发生率, 而建立结肠炎相关结肠癌动物模型是对于其中的机制研究及治疗方法探索的基础。本研究在小鼠腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)基础上，再给予饮用浓度为2%的葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)饮用水来建立溃疡性结肠炎相关结肠癌动物模型。

1　材料和方法

1.1小鼠及主要试剂

5周龄C57BL/6J雄性小鼠，体质量15-20 g,购于北京海斯莱克实验动物中心。小鼠饲养于山西医科大学公共卫生学院毒理学实验动物中心，自由饮水、饲以普通颗粒饲料。氧化偶氮甲烷(AOM)购于美国Sigma公司；葡聚糖硫酸钠(DSS)，分子量36 000-50 000，购于MP Biomedical公司。

1.2小鼠溃疡性结肠炎相关结肠癌模型的制作

5周龄C57BL/6J雄性小鼠17只被随机分实验组(10只)和对照组(7只)。参照文献[3]的方法，实验组小鼠先以AOM 10 mg/kg体重腹腔注射1次，1周后以2% DSS饮用水饮用4 d，之后以普通饮用水连续饮用17 d为1个周期；重复3个周期；对照组小鼠腹腔注射生理盐水，后普通饮食喂养。

1.3小鼠溃疡性结肠炎相关结肠癌模型临床表现观察

试验期间，每天观察动物健康状况，包括毛色、活动、粪便性状，有无肉眼血便及脱肛等情况，每周测量小鼠体重1次。实验期间不禁食。

1.4小鼠溃疡性结肠炎相关结肠癌模型的指标评价

试验结束后，乙醚麻醉处死小鼠，分离肛门至回盲部连接处整段大肠。沿肠纵轴切开大肠，生理盐水冲洗，测量大肠的长度。解剖镜大体观察，按照文献[4]的方法对结肠进行炎症评分和黏膜息肉评分[4]。

结肠炎症评分标准如下：当临床症状及结肠出现以下每一项时各记1分，如充血、出血、狭窄、溃疡、血便、黏液、腹泻和粘连，加上结肠距肛门1 cm处或结肠病变部位最厚处的厚度(mm)得分。

结肠息肉评分系统是根据观察到结肠的息肉数目来进行评价：无息肉为0分，1-3个孤立息肉为1分，4个或以上孤立息肉为2分，几个息肉融合成片或隆起呈块状为3分。之后给予10 %中性甲醛对结肠进行固定，经包埋、切片、HE染色，按照文献[4]的方法进行显微镜下肿瘤病理评分。

肿瘤评分标准基于以下3个方面：隐窝(正常为0分，杯状细胞减少为1分；分支状、不规则、隐窝腔扩张为2分；萌芽复合体为3分)；上皮(正常为0分，过度增生或畸形隐窝病灶为1分，轻度不典型增生：核仁增大、轻度深染、细胞核秘籍分层现象为2分，高度不典型增生：细胞核分层、重度深染、多形性、核极性消失为3分)，黏膜下浸润(无为0分，有为1分)。动物尸体由山西医科大学实验动物研究中心统一处理。

1.5统计学分析

所以数据经SPSS13.0软件包进行分析，结果以均数±标准差的形式表示。采用非配对t检验，检验水准取ɑ=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1小鼠结肠癌发展过程中临床表现观察

小鼠皮下注射AOM后其摄食量无明显变化，自主活动如常，排便正常，体重无减轻。随后给予DSS，小鼠的摄食量呈现逐渐下降趋势，活动也逐渐减少。在第1个试验周期，实验组小鼠在给予DSS后的第2天有2例出现稀便，第3天有3例小鼠出现血便，第4天增加到5例。2例小鼠有黏液便，血便最长维持5 d后缓解，正常饮水后逐渐恢复。在第2个试验周期，给予DSS后第3天实验组小鼠即有8例出现血便，正常饮水后渐恢复。在第3个试验周期，给予DSS后第1天实验组小鼠即出现血便，第3天所有小鼠均出现血便或黏液血便，最长持续7 d，改自来水后逐渐缓解。在整个实验结束时，出现血便的小鼠均出现脱肛现象。此时所有的小鼠均反应迟钝，活动减少，动作缓慢不灵。对照组小鼠无异常表现。

2.2小鼠结肠癌发展过程中饮食及体质量的变化

给予AOM后，实验组小鼠的进食、饮水量与对照组小鼠无明显差异。而给予DSS后，实验组小鼠的进食、饮水均减少。换用正常饮水后，小鼠进食、饮水逐渐恢复。在第1周期和第3周期饮用DSS期间，实验组小鼠体重增加低于对照组，且差异有统计学意义(P=0.001 3和P=0.013)； 在第2周期，两组小鼠体质量增加虽无统计学差异(P>0.05)，但实验组小鼠仍低于对照组。实验结束时，实验组小鼠体质量平均增加程度显著低于对照组(P=0.004)。

表1不同处理后小鼠体质量变化(g)

Table 1Changes of body weight of mice before and after treatment(g)

分组n体质量增加(g)第1周期第2周期第3周期整个实验前后实验组100.12±0.360.14±0.28-1.32±0.393.8±0.92对照组72.40±0.500.23±0.13 2.20±1.398.1±0.79 t3.930.2472.2833.386 P0.00130.8080.01260.0041

2.3小鼠溃疡性结肠炎相关性结肠癌的病理改变

实验结束时，实验组小鼠的大肠与周围组织粘连加重，肠壁有不同程度的充血、水肿，肠道皱褶减少或消失，肠道质地变硬。实验组小鼠大肠均可见一处或多处直径5-11 mm息肉样圆形隆起，大多数位于结肠远端，其次为结肠中段，结肠近口侧没有肿瘤形成(见图1)。实验结束时的大体解剖镜炎症评分及息肉评分结果显示，实验组炎症评分指数、息肉评分指数和显微镜下肿瘤评分指数均显著高于正常对照组，且有统计学差异(P<0.05)。病理HE切片，可见对照组腺体结构正常，没有杯状细胞减少，高倍镜上皮正常，无不典型增生(见图2A、B)；实验组腺体排列紊乱，杯状细胞减少，隐窝腔扩张，分支状畸形，上皮过度增生，高倍镜下核仁增大，

细胞核分层，重度深染，多形性，有黏膜下浸润(见图2C、D)。所有实验组小鼠肠道有不同程度的炎症表现：渗出、白细胞浸润、黏膜溃疡或坏死等。实验组有5例(50%)小鼠发展成结肠癌，表现为高度不典型增生或早期浸润癌等。有脱肛的小鼠，大肠息肉样隆起数量多，发生部位多，容易融合成大的肿瘤(见图1)，病理切片表现较严重，呈白细胞渗出、浸润、黏膜溃疡或坏死、腺体不典型增生及浸润癌等(见图2)。

表2小鼠大肠炎症评分、息肉评分及肿瘤病理评分

Table 2Inflammation score, polyp score and tumor pathological score in colon of mice

分组n大体解剖镜评分炎症评分息肉评分显微镜下肿瘤评分试验组105.52±0.941.50±0.27 5.10±0.41 对照组70.71±0.020.14±0.141.13±0.30t4.8424.4827.538P0.00020.0002<0.0001

图1　小鼠结肠大体表现及脱肛现象Figure 1　Gross appearance of colon and prolapse phenomenon of mice

A.对照组×40倍　　　　　B.对照组×400倍　　　　　C.实验组×40倍　　　　　D.实验组×400倍图2　不同处理小鼠大肠病理HE染色显微镜下表现Figure 2　Pathology of colon in mice after different treatment under microscope after HE staining

3　讨论

目前已经建立了多种结肠炎相关结肠癌模型，如用IL-10基因敲除小鼠制作的结肠癌模型[7]，是一类以结肠炎症相关遗传缺陷为基础的动物结肠癌模型，此种小鼠通常在完全无菌的环境中生长，当在有螺杆菌的环境中饲养时就会逐渐出现溃疡性结肠炎甚至发展到结肠癌。IL-2或Muc2等基因敲除也能造出炎症性肠病相关结肠癌动物模型[8]。通过移植肿瘤细胞株的方法也可以制作结肠癌模型，但是难以观察到由炎症向肿瘤转化的过程。更常用的是化学诱导的方法制作的动物模型，如饮水中加入DSS,可在动物身上复制结肠炎相关临床症状、体征及病理学改变，这些表现与人类溃疡性结肠炎相类似，但是单独使用DSS时结肠癌模型成功的比例较低，单独使用化学试剂比如1,2-二甲肼或氧化偶氮甲烷时成癌率不高，且耗时较长[9]。一些研究报道采用结合饮用DSS水加上注射DMH或AOM制造溃疡性结肠炎相关小鼠结肠癌模型，可以很好地解决了上述存在的问题[10,11]。

本研究联合使用AOM和DSS处理小鼠制造溃疡性结肠炎相关结肠癌动物模型。AOM是一种结肠癌致癌剂，它通过细胞膜和DNA的过氧化，引起结肠黏膜细胞的过度增殖。AOM能在啮齿动物大肠内诱导出体征、病理变化方面和人类结肠癌相似，是一种结肠基因毒性的致癌剂，被广泛应用于研究啮齿动物结肠癌发病机制等[12]。DSS是由蔗糖合成的一种硫酸多糖体，通过其细胞毒性作用干扰肠道淋巴细胞和上皮细胞之间的关系，激活肠道的免疫系统，刺激肠道上皮细胞产生细胞因子，增加中性粒细胞的集聚，造成溃疡性结肠炎的形成，其临床特点与人类溃疡性结肠炎非常相近，是一种非基因毒性的结肠致癌剂，在啮齿动物中被广泛应用于制作溃疡性结肠炎模型，它是一种能刺激结肠癌变的炎症诱导剂[13,14]。

本实验结果显示，联合使用AOM和DSS建立的小鼠溃疡性结肠炎相关性大肠癌模型，与人类溃疡性结肠炎相关性大肠癌在临床体征及病理变化方面相似，较好地模拟了人类溃疡性结肠炎相关性大肠癌的发生发展过程，可被用于结肠癌发生、发展机制的研究。

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Establishment of a mouse model of ulcerative colitis-associated colorectal cancer

ZHANG Rui1,2, ZHU Na1, MA Jing3, ZHANG Wenping4, LIU Jinchun3, YUAN Lili1*

(1DepartmentofGastroenterology,ShanxiAcademyofMedicalSciences,ShanxiDayiHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030032,China;2SecondClinicalMedicalCollegeofShanxiMedicalUniversity;3FirstClinicalMedicalCollegeofShanxiMedicalUniversity;4SchoolofPublicHealth,ShanxiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:Dangyuan831@sina.com)

ObjectiveTo establish a colitis-associated colorectal cancer mouse model.MethodsThe 5-week-old C57BL/6J male mice were randomized into experiment group(n=10) and control group(n=7). The mice in experiment group were intraperitoneally injected with azoxymethane(AOM,10 mg/kg body weight), and then given the water including 2% DSS for 4 d and finally regular water for 17 d. The process repeated 3 times. The mice in control group were given only regular water. The colon was observed under dissecting microscope, and colon inflammation score, mucosal polyp score and pathological score were evaluated and analyzed with the unpairedttest(ɑ= 0.05).ResultsNo obvious changes happened in only AMO-treated mice, but after giving DSS, half of the mice showed the bloody stools and gradually got worse. At the end of experiment, the mice in expriment group showed less activity, and all the mice with bloody stools showed rectal prolapse. The mice in control group had no change. The mice in experiment group showed less weight gain than in control group. At the end of the experiment, all mice showed dysplasia/cancer in middle distal colon in experiment group, and gross anatomy mirror inflammation score, polyp score and pathological tumor rates were significantly higher than in control group(P<0.05).ConclusionAOM followed by DSS can effectively induce the formation of colitis-induced colorectal cancer in mice.

ulcerative colitis-associated colorectal cancer;azoxymethane;dextran sodium sulfate;animal model

山西省留学人员管理委员会科研基金资助项目(晋留办发2010-14-97)

张瑞，男，1969-11生，硕士，副主任医师,E-mail：zhangruim@hotmail.com

2016-05-06

R735.35

A

1007-6611(2016)08-0720-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.010